豬蓋塔病毒分離與鑒定技術(shù)規(guī)范

豬蓋塔病毒分離與鑒定技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了豬源蓋塔病毒分離與鑒定方法。本文件適用于豬及其產(chǎn)品中蓋塔病毒病原分離和鑒定、實(shí)驗(yàn)室診斷、監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。GETV：蓋塔病毒PBS：磷酸緩沖液DMEM：細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液FBS：胎牛血清HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸BHK-21：乳倉(cāng)鼠腎源細(xì)胞CPE：細(xì)胞病變DNAmarker：DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑與設(shè)備試劑與耗材所用生化試劑均為分析純；按GB/T6682（所有部分）一級(jí)水要求實(shí)驗(yàn)用書應(yīng)經(jīng)滅菌或采用超純水；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×PCR混合液、1%的X脂糖凝膠、DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記（100bp~2000bp）；BHK-21、DMEM培養(yǎng)基、FBS、HEPES緩沖液（1mol/L儲(chǔ)存液）、25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、0.22μm的一次性濾頭、0.01mol/LpH7.0~7.4PBS（參見附錄A）；陽(yáng)性對(duì)照：GETV標(biāo)準(zhǔn)毒株；陰性對(duì)照：BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)上清。主要儀器設(shè)備微量移液器、組織破碎儀、組織研磨器、核酸提取儀、PCR儀、通用型電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、倒置生物顯微鏡、37℃恒溫培養(yǎng)箱、冰箱（2℃~8℃、-20℃、-70℃）樣品的采集、保存與運(yùn)輸豬只臨床發(fā)病特征在蚊蟲多發(fā)季節(jié)，即每年5月至10月，豬只已正常免疫豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等疫苗，其新生仔豬出現(xiàn)腹瀉、厭食、皮膚紅變、舌顫、肢體不協(xié)調(diào)，10日齡以上小豬出現(xiàn)精神頹廢、發(fā)熱、食欲減退、日增重顯著下降和妊娠母豬出現(xiàn)繁殖障礙綜合征等臨床癥狀時(shí)，均可認(rèn)為疑似豬蓋塔病毒感染。臨床樣品的采集采取疑似豬蓋塔病毒感染的淋巴結(jié)、胎盤、羊水、死胎、肺、肝、腎、小腦等靶組織約2~5g或血液樣品1~2mL，組織裝入無(wú)菌自封樣品袋或離心管，血液裝入抗凝血管中，編號(hào)。保存與運(yùn)輸采集的樣品應(yīng)按照《獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范》（NY/T541-2016，所有部分）要求包裝和運(yùn)輸，盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；若超過(guò)24h，應(yīng)放置低于-20℃冰箱，不宜反復(fù)凍融。病毒的細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒分離應(yīng)按照《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489，所有部分）在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。樣品的處理組織樣品取0.5~1g待檢組織樣品，加入1~1.5mlPBS，于研缽或組織勻漿器中充分研磨，或用組織破碎儀充分破碎，用含青、鏈霉素的DMEM作3∶1（V/W）稀釋。反復(fù)凍融3次后，4℃3000r/min離心10min，取上清液，以0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌后，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)，-70℃保存?zhèn)溆?。血液樣品用含青、鏈霉素的DMEM作3∶1（V/W）稀釋。反復(fù)凍融3次后，3000r/min離心10min，取上清液，以0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌后，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管編號(hào)，-70℃保存?zhèn)溆?。制備單層?xì)胞按常規(guī)法將BHK-21細(xì)胞分裝在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶分裝含8%FBS的DMEM培養(yǎng)基5mL，細(xì)胞濃度應(yīng)為2×105個(gè)/mL~3×105個(gè)/mL，培養(yǎng)48h。接種細(xì)胞取6.1中的上清液0.2mL接種到生長(zhǎng)狀況良好的單層BHK-21細(xì)胞上（5mL工作體積）。每份樣品接種2-4瓶細(xì)胞，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照2-4瓶。37°C吸附1h，棄上清，加入2ml含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48h。病毒收獲每天觀察記錄細(xì)胞病變（CPE），若被檢樣品中有GETV，通常在接種12~48h內(nèi)可出現(xiàn)CPE，感染BHK-21細(xì)胞后約12h，細(xì)胞出現(xiàn)空洞；24h后細(xì)胞明顯變圓，部分開始脫落；36h后大量脫離，貼壁細(xì)胞大部分變圓。對(duì)照細(xì)胞單層應(yīng)完好，細(xì)胞形態(tài)基本正常或稍有衰老。若出現(xiàn)CPE，將接毒細(xì)胞反復(fù)凍融三次，4℃3000r/min離心10min，收獲病毒上清液，置-70℃保存，進(jìn)行病毒核酸鑒定。若接種細(xì)胞第1代72h后未出現(xiàn)CPE，按上述收毒方法收獲細(xì)胞/病毒液再接種生長(zhǎng)良好的單層細(xì)胞進(jìn)行盲傳，即1mL第一代細(xì)胞/病毒液加4mL細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)。如此盲傳3代，再進(jìn)行鑒定。病毒核酸鑒定對(duì)6.4中收集到細(xì)胞/病毒液，或經(jīng)6.1處理后的臨床樣品，用RT-PCR方法進(jìn)行核酸鑒定，可使用商品化的兩步法或一步法RT-PCR反應(yīng)試劑盒，本標(biāo)準(zhǔn)推薦使用兩步法RT-PCR反應(yīng)試劑盒。RNA的提取選擇商品化RNA柱式法或磁珠法提取試劑盒，按照說(shuō)明書提取RNA，同時(shí)應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品。RNA提取操作應(yīng)在通風(fēng)柜或生物安全柜中進(jìn)行，避免RNA氣溶膠的污染。反轉(zhuǎn)錄（cDNA的合成）配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，使用商品化反轉(zhuǎn)錄試劑盒將7.1中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體操作、體系參照說(shuō)明書進(jìn)行，cDNA于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增PCR引物上游引物（10μmol/L）：5’-ACCGAAGAAGCCGAAGAA-3’

下游引物（10μmol/L）：5’-GCACTCRAGGTCATACTTG-3’PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系見表1。表1RT-PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)試劑總體積10μLμL2×TaqPCRmasterMix5上游引物（10μmol/L）0.5下游引物（10μmol/L）0.5cDNA模板1ddH2O（無(wú)菌水）3PCR反應(yīng)程序反應(yīng)程序見表2。表2RT-PCR反應(yīng)程序步驟時(shí)間和溫度min、s/℃循環(huán)數(shù)個(gè)預(yù)變性5min/95℃1變性30s/95℃35退火30s/56℃延伸30s/72℃延伸7min/72℃1X脂糖凝膠電泳成像PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取適量擴(kuò)增產(chǎn)物加到1%的X脂糖凝膠加樣孔中，并加入陽(yáng)性、陰性對(duì)照和DNAmarker。使用電泳儀進(jìn)行電泳，電壓大小根據(jù)電泳槽長(zhǎng)度確定，一般控制在4V/cm~6/cm，電泳時(shí)間為10~20min。電泳結(jié)束后，將凝膠放在凝膠成像儀中觀察記錄成像結(jié)果。結(jié)果判定RT-PCR成立條件對(duì)照成立，即電泳結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照在316bp左右出現(xiàn)目的DNA條帶且陰性對(duì)照無(wú)條帶。陰性判定電泳結(jié)果未出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照316bp一致的DNA條帶，判定為：GETV核酸陰性。陽(yáng)性判定電泳結(jié)果出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照316bp一致的DNA條帶，判定為：GETV核酸陽(yáng)性，對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序，其結(jié)果與附錄B.1序列比對(duì)，進(jìn)行確認(rèn)。病毒分離鑒定細(xì)胞發(fā)生CPE、核酸鑒XX果為陽(yáng)性，且測(cè)序比對(duì)結(jié)果正確，則判定為：GETV分離鑒定陽(yáng)性。若盲傳3代后，細(xì)胞并未發(fā)生CPE，但核酸鑒XX果為陽(yáng)性，則繼續(xù)盲傳至5代后，在進(jìn)行核酸鑒定，若核酸鑒XX果仍為陽(yáng)性，且測(cè)序比對(duì)結(jié)果正確，則判定為：GETV分離鑒定陽(yáng)性，若核酸鑒定變?yōu)殛幮?，則判定為：GETV分離鑒定陰性。若盲傳3代后，細(xì)胞并未發(fā)生CPE，核酸鑒XX果為陰性，則判定為：GETV分離鑒定陰性。

（規(guī)范性附錄）

試劑配制（規(guī)范性附錄）

試劑配制0.01mol/LPBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO4?12H2O3.58gKH2PO40.27g滅菌雙蒸水800mLNaOH或者HCl調(diào)pH值7.0至7.4，滅菌雙蒸水定容至1000mL，121℃、15min高壓鍋滅菌冷卻，置常溫或4℃?zhèn)溆?。電泳緩沖液TAE（50倍）三羥甲基甲烷堿（Trisbase）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100mL蒸餾水100mL待上述混合物完全溶解后，加蒸餾水至1000mL，置4℃冰箱中備用，如配制1%的X脂糖凝膠和用作電泳緩沖液，則用蒸餾水稀釋50倍，成TAE電泳緩沖液。1.0%X脂糖凝膠板制備X脂糖1.0g1×TAE緩沖液100mL0.5ug/mL溴化乙錠5uL微波爐充分溶解后，加入溴化乙錠，倒入凝膠板中，在距離底板0.5mm的位置上放置梳子，凝膠的厚度為4mm，待凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠板放入電泳槽中，電泳緩沖液沒過(guò)膠面。

（資料性附錄）

豬源蓋塔病毒簡(jiǎn)介和CAP基因擴(kuò)增序列豬源蓋塔病毒簡(jiǎn)介蓋塔病毒（Getahvirus）廣泛分布在歐洲、亞洲、大洋洲是披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒屬（Alphavirus）成員。該病毒粒子呈球形，有囊膜及纖突，直徑約70nm，單股正鏈RNA，病毒基因組全長(zhǎng)約11~12kp，編碼區(qū)包含2個(gè)獨(dú)立開放閱讀框ORF和ORF2；ORF1長(zhǎng)約7407bp，編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1、NSP2、NSP3和NSP4；ORF2長(zhǎng)約3759bp，編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白Cap、E3、E2、6K和E1。衣殼蛋白Cap基因全長(zhǎng)804bp，該基因高度保守、對(duì)病毒顆粒的形成和存活至關(guān)重要，常被用作該病毒的檢測(cè)、鑒定。1955年Scherer等首次在馬來(lái)西亞橡膠林中生存的白雪庫(kù)蚊（Culexgelidus）中分離得到該病毒，GETV可感染多種動(dòng)物并引起馬和豬發(fā)病，其癥狀表現(xiàn)為發(fā)燒、蕁麻樣皮疹和后肢水腫，實(shí)驗(yàn)室條件下，GETV能夠感染兔、小鼠、豚鼠和倉(cāng)鼠等，并能夠引起新生乳鼠死亡。在動(dòng)物尸檢中，一般表現(xiàn)為腎臟畸形、腎臟表面有斑點(diǎn)出血，腸壁薄、有空泡半透明，全身淋巴結(jié)充血腫大，除此之外可能在其他器官未能觀察到大體病變。自2017年我國(guó)首次在XX省感染豬群中檢出GETV以來(lái)，XX、XX、XX等地豬群也報(bào)道發(fā)現(xiàn)此病，XX省發(fā)生大規(guī)模豬群感染GETV引發(fā)大量流產(chǎn)導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失，表明該病毒在我國(guó)已廣泛分布，對(duì)我國(guó)生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來(lái)困擾，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。中國(guó)有關(guān)GETV研究主要集中于蚊源GETV檢測(cè)和病毒分離，不同動(dòng)物包括豬、羊、鴨等動(dòng)物的血清學(xué)調(diào)查，在流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)GETV易與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型和3型（PCV2和PCV3）、豬非典型瘟病毒（APPV）等病毒混合感染的情況。最近兩年，GETV在不同宿主之間的疫情在迅速蔓延，對(duì)于馬和豬，GETV尚無(wú)特效治療方法。豬源蓋塔病毒CAP基因擴(kuò)增序列ACCGAAGAA