西藏靈芝的質(zhì)量檢測(cè)及其鑒別研究 中藥學(xué)專(zhuān)業(yè)

前言西藏靈芝為多孔菌科真菌西藏靈芝Ganodermatibetanum的干燥子實(shí)體，一年四季均可采收入藥，是一種品種較為珍惜的藥用真菌。入藥時(shí)應(yīng)先挑走夾在西藏靈芝中的雜草枯葉之類(lèi)的其他雜質(zhì)，再用剪刀剪去附著樹(shù)皮、泥沙或培養(yǎng)基的下端菌柄。保存時(shí)應(yīng)先陰干或在40～50℃左右的溫度烘干，在密封，避光，干燥的條件下存放，避免冷藏導(dǎo)致藥材受潮。靈芝一藥，史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，稱靈芝有"益心氣"、"安精魂"、"補(bǔ)肝益氣"、"好顏色"、"久食可輕身不老，延年益壽"的功效。目前靈芝的品種較多，在世界上有記錄的約有110余種，《中國(guó)藥典》2015年版一部收載的靈芝為擔(dān)子菌類(lèi)多孔菌科真菌赤Ganodermalucidum(Leyss.exFr.)Karst.或紫芝GanodermasinenseZhao,XuetZhang.的干燥子實(shí)體。根據(jù)《中國(guó)靈芝圖鑒》的記載，西藏靈芝多分布西藏、海南等省區(qū)。西藏靈芝以其干燥子實(shí)體入藥，有具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化、抗過(guò)敏、降血脂、抗衰老作用、保肝護(hù)肝之功效[1]。西藏靈芝所含的化學(xué)成分比較復(fù)雜，目前研究較多的化學(xué)成分有：多糖類(lèi)、三萜類(lèi)、核苷類(lèi)、甾醇類(lèi)、生物堿類(lèi)、氨基酸多肽類(lèi)、無(wú)機(jī)元素、脂肪酸等。靈芝多糖是靈芝最主要的有效成分，具有提高機(jī)體的免疫力和耐缺氧能力，抑制腫瘤，消除自由基等藥理活性。靈芝中的三萜類(lèi)成分是靈芝中一類(lèi)特有的成分，種類(lèi)很多，它們是靈芝的苦味成分，其含氧官能團(tuán)對(duì)苦味的產(chǎn)生起重要作用，具有解毒，保肝，抗腫瘤，抗炎等功效。此外，靈芝中含有一定量的核苷類(lèi)，甾醇，氨基酸和無(wú)機(jī)元素，分別具有抗病毒，抗腫瘤，提高血液供氧能力，保健等功能[2-4]。張輝等[5]使用高效陰離子交換色譜（HPAEC），甲基化和GLC-MS分析以及1D和2D系統(tǒng)重新闡明靈芝生物活性多糖（PSG-1）的主鏈和支鏈特征的精細(xì)結(jié)構(gòu)NMR光譜學(xué)。張麗霞等[6]研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能顯著增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)小鼠免疫細(xì)胞活性。林秀仙等[7]實(shí)驗(yàn)證明靈芝多糖的最佳提取條件為提取溫度100℃浸提時(shí)間2h浸提次數(shù)3次，料液比為1:30。孫曉梅等[8]開(kāi)發(fā)了在超聲波輔助條件下提取，通過(guò)高效液相色譜（HPLC）與化學(xué)計(jì)量學(xué)手段相結(jié)合快速鑒別和區(qū)分不同靈芝的多糖的指紋分析方法實(shí)驗(yàn)證明不同栽培方式、不同年份以及不同地區(qū)的靈芝三萜的含量和峰形均沒(méi)有明顯的影響，即用三萜類(lèi)有效成分鑒別靈芝方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好[9-10]。劉寧等[11]對(duì)提取方法進(jìn)行考察，比較了超聲提取、氯仿回流，甲醇回流，結(jié)果表明甲醇回流效果最佳。黃書(shū)銘等[12]利用紫外分光光度法在提取三萜類(lèi)化合物工藝的中間階段，即堿提的NaHCO3層進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出樣品中三萜類(lèi)化合物的含量，從而快速檢測(cè)和定量分析靈芝中的三萜類(lèi)成分。2儀器與材料2.1儀器電子天平(TP-214/LF225DR)、電熱干燥箱（東方-E型）、三用紫外分析儀（ZF-C型）、低速臺(tái)式離心機(jī)（TDL-80-2B）、電阻爐（SX2-2/S-10）、顯微鏡（FINDER）、紫外分光光度計(jì)(L6S)、超聲波處理器(KQ2000E)2.2材料試劑：分析純（甲醇，甲酸，乙醇，高氯酸，甲酸乙酯，乙酸乙酯，硫酸，蒽酮，香草醛，冰醋酸，石油醚）、蒸餾水。對(duì)照藥材：西藏靈芝對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120968-201408）葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110833-201205）齊墩果酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110709-201206）西藏靈芝藥材（由中山市香港啟泰中藥飲片有限公司提供，產(chǎn)地均為西藏，批號(hào)：20180203、20180204、20180205）3實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果3.1來(lái)源鑒別通過(guò)查找文獻(xiàn)，西藏靈芝子實(shí)體一年生。菌蓋半圓形或腎形，2.5～11.3cm×5.8～19.3cm，厚約0.5～3.2cm，表面由原基時(shí)的白色轉(zhuǎn)變至成熟后的橙黃色或絳紅色，有漆樣光華，表面有環(huán)狀輪紋，未成熟時(shí)子實(shí)體邊緣部分較鈍呈嫩白色；背面白色，孢子彈射后呈較淺的褐色；菌肉分層不明顯；菌柄側(cè)生、偏生或中生，長(zhǎng)約5～8cm，粗約1～3cm，狀似圓柱形，一般菌柄內(nèi)的菌肉為白色，外部的菌肉呈絳紅色與菌蓋同色。成熟后的子實(shí)體木質(zhì)化，韌性增加，而西藏靈芝在剛采摘時(shí)的水分含量大約在51%～67%之間。西藏靈芝所屬的群落大部分以灌木層和草本層為主。群落中種類(lèi)最多的科是菊科、薔薇科及禾本科。西藏野生靈芝主要分布林芝地區(qū)的工布江達(dá)縣、林芝縣、米林縣、波密縣和察隅縣等地，分布的海拔范圍在2050～3100米之間，主要腐生樹(shù)種是川滇高山櫟、通麥櫟和桃樹(shù)。以陽(yáng)坡居多，由于靈芝生長(zhǎng)需要潮濕環(huán)境，靈芝生存環(huán)境中的濕度多在70%～95%之間，對(duì)溫度的要求不是很高，一般在10～25℃之間，靈芝生長(zhǎng)環(huán)境的樹(shù)木郁閉度一般在70%～90%之間，即“二三分陽(yáng)七八分陰”[13]。圖1西藏靈芝原植物 圖2西藏靈芝原植物3.2原藥材鑒別本品為藥用真菌西藏靈芝的干燥子實(shí)體，子實(shí)體中等或稍大。菌蓋半圓形，腎形或近圓形，木栓質(zhì)，寬5～15cm，厚0.8～1.0cm，紅褐色并有油漆光澤，菌蓋上具環(huán)棱紋和輻射狀皺紋，邊緣薄，往往內(nèi)卷。菌肉白色至淡褐色。管孔面初期白色，后期變淺褐色、褐色，平均3～5個(gè)/mm。柄側(cè)生，與菌蓋近垂直，少數(shù)偏生呈扇狀，長(zhǎng)8～15cm，粗1～3cm，紫褐色，有光澤。擔(dān)孢子褐色，卵形，中央含一個(gè)大油滴。表1西藏靈芝的三批樣品序號(hào)品名批號(hào)產(chǎn)地123西藏靈芝西藏靈芝西藏靈芝201802032018020420180205西藏西藏西藏圖3西藏靈芝樣品圖3.3顯微鑒別圖3西藏靈芝樣品圖3.3.1方法取藥用真菌西藏靈芝粉末少許，置于潔凈的載玻片上，滴加1—2滴香草醛冰醋酸溶液，輕輕蓋上蓋玻片，用鑷子小心排出載玻片與蓋玻片之間的氣泡，然后將預(yù)處理好的裝片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。3.3.2結(jié)果菌絲近無(wú)色到帶褐色，有分枝，多彎曲，直徑1.5～6微米，壁厚，無(wú)隔膜。菌絲系統(tǒng)三體型:生殖菌絲透明，薄壁，分枝，直徑3～4微米；骨架菌絲淡黃褐色，厚壁到實(shí)心，樹(shù)狀分枝，骨架干直徑4～5微米，分枝末端形成鞭毛狀無(wú)色纏繞菌絲，纏繞菌絲厚壁，分枝，直徑1～2微米。孢子卵形，或頂端平截，雙層壁，外壁無(wú)色，平滑，內(nèi)壁有小刺，淡褐色或近褐色，有時(shí)中間有一油滴，8.5～11.2(12.1)×5.2～6.9微米。如附錄圖4，5，6。3.4薄層色譜鑒別3.4.1樣品制備取本品粉末2g，加乙醇30ml，加熱回流30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取靈芝對(duì)照藥材2g，同法制成對(duì)照藥材溶液。3.4.2薄層色譜條件照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液4μl，三次吸取樣品溶液4μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。（結(jié)果見(jiàn)圖7）43214321注：1為對(duì)照藥材，2～4為供試品圖7西藏靈芝薄層色譜圖3.4.3結(jié)果如圖7，三個(gè)不同批號(hào)的西藏靈芝在對(duì)照品相應(yīng)的位置上均可見(jiàn)到相同顏色的斑點(diǎn)，說(shuō)明這三個(gè)不同批號(hào)的西藏靈芝藥材均含有與對(duì)照藥材相同的成分。3.5水分的測(cè)定3.5.1方法照水分測(cè)定法《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0832第二法依法測(cè)定，不得超過(guò)17.0％。扁形稱量瓶恒重：取扁形稱量瓶置于烘箱內(nèi)，打開(kāi)瓶蓋在烘箱內(nèi)105℃干燥5小時(shí)，將瓶蓋好，移置干燥器中，冷卻30分鐘，精密稱定重量，再在上述溫度干燥1小時(shí)，冷卻，稱重，重復(fù)干燥、稱重至連續(xù)兩次稱重的差異不超過(guò)0.3mg為恒重(W0)。取本品(2～5g)剪碎，平鋪于干燥至恒重的扁形稱瓶中，厚度不超過(guò)5mn，精密稱定為（W1），打開(kāi)瓶蓋在105℃干燥5小時(shí)，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30分鐘，精密稱定重量(W2)，再在上述溫度干燥1小時(shí)，冷卻，精密稱定重量(W2)。重復(fù)干燥、稱重至連續(xù)兩次稱重的差異不超過(guò)5mg。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中的含水量（％）。計(jì)算公式:式中：W1—樣品重量（g）W0—稱量瓶空瓶重量（g）W2—（稱量瓶＋樣品）干燥后重量（g）3.5.2結(jié)果表2西藏靈芝的水分含量測(cè)定（％）編號(hào)西藏靈芝批號(hào)空瓶重1（g）空瓶重2（g）樣品量（g）干燥后瓶+樣品1（g）干燥后瓶+樣品2（g）水分（%）水分平均（%）RSD（%）12018020350.964650.96445.065255.355255.354913.3213.40.4758.843258.84315.026263.194263.193813.4422018020450.856650.85655.041655.203455.203113.7913.780.1558.793158.79295.073563.168363.168213.7632018020552.308252.30805.017456.716956.716612.1312.140.1254.137654.13735.092158.610958.610712.15由表2可知，批號(hào)為20180203的西藏靈芝藥材平均水分含量為13.4％，批號(hào)為20180204的西藏靈芝藥材平均水分含量為13.8％，批號(hào)為20180205的西藏靈芝藥材平均水分含量為12.1％。三批不同批號(hào)的西藏靈芝藥材的平均水分含量為13.1％，均不超過(guò)17％，合格率100％。從藥材的水分含量來(lái)看，三個(gè)不同批號(hào)的西藏靈芝藥材均符合《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0832第二法的要求。3.6總灰分的測(cè)定3.6.1方法照灰分測(cè)定法《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2302法測(cè)定，總灰分不得超過(guò)3.2％?？折釄搴阒厝≯釄逯糜诟邷貭t內(nèi)，將蓋子斜蓋在坩堝上，經(jīng)500～600℃熾灼約30～60分鐘，取出坩堝，稍冷片刻，移置干燥器內(nèi)并蓋上蓋子，放冷至室溫，精密稱定坩堝重量，再在上述條件下熾為約30分鐘；取出，置干燥器內(nèi)，放冷，稱重，重復(fù)熾灼直至連續(xù)兩次熾灼后的重量差異在0.3mg以下的重量即為恒重(W0)取本品約5.0g(已粉碎，可通過(guò)二號(hào)篩，并混合均勻)，置已熾灼至恒重的堝內(nèi)，精密稱定為W1，置電爐上緩緩熾熱，避免燃燒，至完全炭化。將坩堝移置高溫爐內(nèi)，蓋子斜蓋于坩堝上，在500～600C只灼使供試完全灰化。冷卻，稱重，重復(fù)熾灼直至連續(xù)兩次熾灼后的重量差異在0.3g以下的重量即為恒重，記為W2。(如供試品不易灰化，可將坩堝放冷，加熱水或10%硝酸銨溶液2ml使殘?jiān)鼭駶?rùn)，然后置水浴上蒸干，殘?jiān)涨胺胱?，至坩堝?nèi)容物完全灰化。)。根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算供試品中總灰分的含量（％）。計(jì)算公式式中：W1—樣品量（g）W0—空坩堝恒重（g）W2—（灰化后坩堝＋樣品）恒重（g）3.6.2結(jié)果表3西藏靈芝的總灰分含量測(cè)定（％）編號(hào)西藏靈芝批號(hào)坩鍋原始恒重1(g)坩鍋原始恒重2(g)取樣量(g)坩堝+供試品恒重1（g）坩鍋+供試品恒重2(g)總灰分（%）總灰分平均（%）RSD（%）12018020355.536255.53595.139855.650755.65052.232.261.5754.770554.77045.044154.885454.88522.2822018020454.584454.58425.073854.689854.68952.082.101.3556.317556.31735.152756.426656.42632.1232018020550.473850.47375.217650.596550.59632.352.360.6053.826353.82615.118453.947653.94732.37由表3可知，批號(hào)為20180203的西藏靈芝藥材總灰分含量為2.26％，批號(hào)為20180204的蘇西藏靈芝藥材總灰分含量為2.1％，批號(hào)為20180205的西藏靈芝藥材總灰分含量為2.36％。三批不同批號(hào)的西藏靈芝藥材的平均總灰分含量為2.24％，均不超過(guò)3.2％，合格率100％。從藥材的總灰分含量來(lái)看，三個(gè)不同批號(hào)的西藏靈芝藥材均符合《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2302的要求。3.7水溶性浸出物的測(cè)定3.7.1方法照水溶性浸出物測(cè)定法《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2201項(xiàng)下的熱浸法依法測(cè)定，不得少于3.0％。蒸發(fā)皿恒重：取蒸發(fā)皿置于烘箱內(nèi)100～105℃干燥5小時(shí)，移置干燥器中，冷卻30分鐘，精密稱定重量，再在上述溫度干燥1小時(shí)，冷卻，稱重，重復(fù)干燥、稱重至連續(xù)兩次稱重的差異不起過(guò)0.3mg為恒重，記為W0。精密稱定供試品W1，置于250的提形瓶中，精密加入純化水100m1，塞緊，稱定重量，靜置1小時(shí)后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持做沸1小時(shí)，放冷后，取下錐形瓶，密塞，稱定重量，用純化水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過(guò)。精密量取液25m1，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小時(shí)，置于干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量W2。計(jì)算公式：式中：W0—恒重的蒸發(fā)皿（g）W2—?dú)堅(jiān)?蒸發(fā)皿干燥后總量（g）W1—樣品重（g）3.7.2結(jié)果表4西藏靈芝的水溶性浸出物含量測(cè)定（％）編號(hào)批號(hào)空蒸發(fā)皿重1（g）空蒸發(fā)皿重2（g）稱樣量（g）樣品+蒸發(fā)皿重（g）浸出物（%）平均值（%）RSD(%)12018020352.307152.30724.001252.36595.875.821.251.476351.47614.025951.53425.7722018020450.869650.86954.000950.92495.545.591.152.351752.35164.076152.4095.6332018020551.513851.51373.972951.57245.915.841.850.837250.83714.067250.89575.76由表4可知，批號(hào)為20180203的西藏靈芝藥材水溶性浸出物平均含量為5.82％，批號(hào)為20180204的西藏靈芝藥材水溶性浸出物平均含量為5.59％，批號(hào)為20180205的西藏靈芝藥材水溶性浸出物平均含量為5.84％。三批不同批號(hào)的西藏靈芝藥材的平均水溶性浸出物均不少于3.0％，合格率100％。從藥材的水溶性浸出物含量來(lái)看，三個(gè)不同批號(hào)的西藏靈芝藥材均符合《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2201項(xiàng)下的熱浸法的要求。3.8靈芝多糖的測(cè)定和方法學(xué)考察3.8.1制備對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線多糖對(duì)照品溶液的制備：取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每lml含0.12mg的溶液，即得。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液.0.6、0.8、1.0、1.2ml，分別置10ml具塞試管中，各加水至2.0ml，迅速精密加人硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.1g，加硫酸100ml使溶解，搖勻)6ml，立即搖勻，放置15分鐘后，立即置冰浴中冷卻15分鐘，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法(通則0401)，在625nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表5多糖對(duì)照品含量測(cè)定（％）對(duì)照品溶液123456濃度（ug/ml）24487296120144吸光度（A）0.0860.2110.2600.3520.4640.542多糖濃度（ug/ml）吸光度A多糖濃度（ug/ml）吸光度A圖10西藏靈芝多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線3.8.2靈芝多糖的提取供試品溶液的制備：取本品粉末約2g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水60ml，靜置1小時(shí)，加熱回流4小時(shí)，趁熱濾過(guò)，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水60ml，加熱回流3小時(shí)，趁熱濾過(guò)，合并濾液，置水浴上蒸干，殘?jiān)盟?ml溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75ml，搖勻，在4℃放置12小時(shí)，離心，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，離心，精密量取上清液3ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。3.8.3精密度試驗(yàn)精密吸取2ml經(jīng)3.8.2項(xiàng)下得到的靈芝多糖提取物5份，用硫酸-蒽酮法處理后，在625mm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，計(jì)算得RSD值為1.016%，證明儀器的精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表6。表6精密度試驗(yàn)結(jié)果編號(hào)12345平均值RSD（%）吸光度0.2530.2490.2540.2510.2480.2511.0163.8.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取2ml經(jīng)3.8.2項(xiàng)下得到的靈芝多糖提取物，用硫酸-蒽酮法處理后，在625mm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，每隔5min測(cè)定一次，計(jì)算得RSD值為0.455%，證明儀器和溶液的穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)表7。表7穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果編號(hào)0min5min10min15min20min平均值RSD（%）吸光度0.2490.2500.2500.2510.2520.2500.4553.8.5多糖含量測(cè)定測(cè)定法：精密量取供試品溶液2ml，置10ml具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“迅速精密加入硫酸蔥酮溶液6m1”起，同法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的含量，計(jì)算，即得。本品按干燥品計(jì)算，含靈芝多糖以無(wú)水葡萄糖(CH12O)計(jì)，不得少于0.90%。計(jì)算公式：W=c*n/mC：代表供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的量n：代表供試品溶液稀釋倍數(shù)m：代表供試品的重量3.8.6結(jié)果表8西藏靈芝的多糖含量測(cè)定（％）編號(hào)西藏靈芝批號(hào)吸光度（A）濃度（ug/ml）取樣量(g)多糖含量（%）多糖含量平均（%）1201802030.25266.71881.40120.95230.930.24965.92311.45830.90412201802040.25467.24931.48250.90720.900.25868.31031.53170.89203201802050.26169.10611.50270.91980.920.25768.04511.48010.9195由表8可知，批號(hào)為20180203的西藏靈芝藥材多糖平均含量為0.93％，批號(hào)為20180204的西藏靈芝藥材多糖平均含量為0.90％，批號(hào)為20180205的西藏靈芝藥材多糖平均含量為0.92％。三批不同批號(hào)的西藏靈芝藥材的多糖含量均不少于0.90％，合格率100％。從藥材的多糖含量來(lái)看，三個(gè)不同批號(hào)的西藏靈芝藥材均符合《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2201的要求。3.9靈芝三萜類(lèi)的測(cè)定和方法學(xué)考察3.9.1制備對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品溶液的制備：取齊墩果酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，分別置15ml具塞試管中，揮干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密稱取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml、高氯酸0.8ml，搖勻，在70"℃水浴中加熱15分鐘，立即置冰浴中冷卻5分鐘，取出，精密加人乙酸乙酯4ml，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法(通則0401)，在546nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表9三萜及甾醇對(duì)照品含量測(cè)定（％）對(duì)照品溶液123456濃度（ug/ml）20406080100144吸光度（A）0.1540.3720.5650.7300.9650.542三萜濃度（ug/ml）吸光度A三萜濃度（ug/ml）吸光度A圖11西藏靈芝三萜及甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線3.9.2靈芝三萜類(lèi)的提取供試品溶液的制備：取本品粉末約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇50ml，超聲處理(功率率140W，頻率42kHz)45分鐘，濾過(guò)，濾液置100ml量瓶中，用適量乙醇，分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。3.9.3精密度試驗(yàn)精密吸取0.2ml經(jīng)3.9.2項(xiàng)下得到的靈芝三萜提取物5份，用香草醛-冰醋酸法處理顯色，在546mm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，計(jì)算得RSD值為1.051%，證明儀器的精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表10。表10精密度試驗(yàn)結(jié)果編號(hào)12345平均值RSD（%）吸光度0.1720.1690.1700.1720.1680.1701.0513.9.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取0.2ml經(jīng)3.9.2項(xiàng)下得到的靈芝三萜提取物，用香草醛-冰醋酸法處理顯色，在546mm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，每隔5min測(cè)定一次，計(jì)算得RSD值為0.668%，證明儀器和溶液的穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)表11。表11穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果編號(hào)0min5min10min15min20min平均值RSD（%）吸光度0.1690.1700.1710.1710.1720.1710.6683.8.5三萜含量測(cè)定測(cè)定法：精密量取供試品溶液0.2ml，置15ml具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“揮干”起，同法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，計(jì)算，即得。本品按干燥品計(jì)算，含三萜及甾醇以齊墩果酸(CH4sO3)計(jì)，不得少于0.50%。計(jì)算公式：W=c*n/mC：代表供試品溶液中齊墩果酸的量n：代表供試品溶液稀釋倍數(shù)m：代表供試品的重量3.9.6結(jié)果表12西藏靈芝的三萜及甾醇含量測(cè)定（％）編號(hào)西藏靈芝批號(hào)吸光度（A）濃度（ug/ml）取樣量(g)三萜含量（%）三萜含量平均（%）1201802030.17120.98992.01820.520.530.15319.17171.80120.532201802040.16420.28281.96150.520.520.17221.09092.02740.523201802050.17621.49501.98560.540.540.17821.69702.03710.53由表12可知，批號(hào)為20180203的西藏靈芝藥材三萜及甾醇平均含量為0.53％，批號(hào)為20180204的西藏靈芝藥材三萜及甾醇平均含量為0.52％，批號(hào)為20180205的西藏靈芝藥材三萜及甾醇平均含量為0.54％。三批不同批號(hào)的西藏靈芝藥材的三萜及甾醇含量均不少于0.50％，合格率100％。從藥材的三萜及甾醇含量來(lái)看，三個(gè)不同批號(hào)的西藏靈芝藥材均符合《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2201的要求。4結(jié)論參考《中國(guó)藥典》2015年版四部檢查通則的方法，對(duì)中藥材西藏靈芝的質(zhì)量控制方法進(jìn)行研究，包括顯微鑒別、薄層板鑒別、水分檢查、總灰分檢查、水溶性浸出物檢查，靈芝多糖檢測(cè)，靈芝三萜類(lèi)和甾醇的檢測(cè)并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果初步擬定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的范圍，為西藏靈芝的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。其中水分含量不得超過(guò)15.7％，總灰分含量不得超過(guò)2.7％，水溶性浸出物不得少于4.6％，多糖含量不少于0.7%，三萜及甾醇類(lèi)含量不少于0.4%。5討論中藥材西藏靈芝在薄層色譜鑒別上，由于其成分復(fù)雜，且國(guó)內(nèi)外對(duì)西藏靈芝成分的研究尚處于起步階段，因此在本實(shí)驗(yàn)中以其對(duì)照藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別比較合適。對(duì)于水分，總灰分測(cè)定結(jié)果得出一個(gè)最大值，并以最大值的120%作為上限；水浸出物、多糖含量和三萜類(lèi)及甾醇含量的測(cè)定則以最低測(cè)定值的80%為限得出值，以此作為下限，為初步制定西藏靈芝的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。

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綜述西藏靈芝藥材質(zhì)量研究現(xiàn)狀1前言西藏靈芝為多孔菌科真菌西藏靈芝Ganodermatibetanum的干燥子實(shí)體，全年采收，除去雜質(zhì)，剪除附有朽木、泥沙或培養(yǎng)基質(zhì)的下端菌柄，陰干或在40～50℃烘干保存，是十分珍惜的藥用真菌。根據(jù)《中國(guó)靈芝圖鑒》的記載，西藏靈芝主要分布西藏、海南等省區(qū)。西藏靈芝以其干燥子實(shí)體入藥，有具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化、抗過(guò)敏、降血脂、抗衰老作用、保肝護(hù)肝之功效[1]。但是目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于西藏靈芝化學(xué)成分、藥理活性及質(zhì)量方面的研究報(bào)道較少，2.1藥源的研究高山櫟、通麥櫟和桃樹(shù)。具有益氣血，安心2.2產(chǎn)地根據(jù)《中國(guó)靈芝圖鑒》的記載，西藏靈芝主要分布西藏、海南等省區(qū)。西藏靈芝所屬的群落大部分以灌木層和草本層為主。群落中種類(lèi)最多的科是菊科、薔薇科及禾本科。西藏野生靈芝主要分布林芝地區(qū)的工布江達(dá)縣、林芝縣、米林縣、波密縣和察隅縣等地，分布的海拔范圍在2050～3100米之間，主要腐生樹(shù)種是川滇高山櫟、通麥櫟和桃樹(shù)。以陽(yáng)坡居多，由于靈芝生長(zhǎng)需要潮濕環(huán)境，靈芝生存環(huán)境中的濕度多在70%～95%之間，對(duì)溫度的要求不是很高，一般在10～25℃之間。靈芝生長(zhǎng)環(huán)境的樹(shù)木郁閉度一般在70%～90%之間，即“二三分陽(yáng)七八分陰”[2]。2.3臨床應(yīng)用西藏靈芝以其干燥子實(shí)體入藥，具有益氣血，安心神，健脾胃的功效。西藏靈芝性平、味甘、無(wú)毒，歸肺、心、脾經(jīng)。主治虛勞，心悸，失眠，頭暈，神疲乏力，久咳氣喘，冠心病，矽肺，腫瘤。臨床應(yīng)用上，西藏靈芝在增強(qiáng)人體免疫力，調(diào)節(jié)血糖，控制血壓，輔助腫瘤放化療，保肝護(hù)肝，促進(jìn)睡眠等方面頗具療效。本品為藥用真菌西藏靈芝的干燥子實(shí)體，子實(shí)體中等或稍大。菌蓋半圓形，腎形或近圓形，木栓質(zhì)，寬5～15cm，厚0.8～1.0cm，紅褐色并有油漆光澤，菌蓋上具環(huán)棱紋和輻射狀皺紋，邊緣薄，往往內(nèi)卷。菌肉白色至淡褐色。管孔面初期白色，后期變淺褐色、褐色，平均3～5個(gè)/mm。柄側(cè)生，與菌蓋近垂直，少數(shù)偏生呈扇狀，長(zhǎng)8～15cm，粗1～3cm，紫褐色，有光澤。擔(dān)孢子褐色，卵形，中央含一個(gè)大油滴。菌絲近無(wú)色到帶褐色，有分枝，多彎曲，直徑1.5～6微米，壁厚，無(wú)隔膜。菌絲系統(tǒng)三體型:生殖菌絲透明，薄壁，分枝，直徑3～4微米；骨架菌絲淡黃褐色，厚壁到實(shí)心，樹(shù)狀分枝，骨架干直徑4～5微米，分枝末端形成鞭毛狀無(wú)色纏繞菌絲，纏繞菌絲厚壁，分枝，直徑1～2微米。孢子卵形，或頂端平截，雙層壁，外壁無(wú)色，平滑，內(nèi)壁有小刺，淡褐色或近褐色，有時(shí)中間有一油滴，8.5～11.2(12.1)×5.2～6.9微米。取藥用真菌西藏靈芝粉末少許，置于潔凈的載玻片上，滴加1—2滴香草醛冰醋酸溶液，輕輕蓋上蓋玻片，用鑷子小心排出載玻片與蓋玻片之間的氣泡，然后將預(yù)處理好的裝片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。取本品粉末2g，加乙醇30ml，加熱回流30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取靈芝對(duì)照藥材2g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)