細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量原則及檢查辦法細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量原則及檢查辦法中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會二0一一年四月編寫闡明根據(jù)中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會9月20日組織召開的《動物細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)管理及質(zhì)量控制學(xué)術(shù)研討會》紀(jì)要，結(jié)合我國的實(shí)際狀況制訂本原則。本原則以《中國藥典》和《哺乳類動物細(xì)胞培養(yǎng)基》（HG/T3935-）行業(yè)原則為根據(jù)，結(jié)合生物制品對細(xì)胞培養(yǎng)基原材料的特殊規(guī)定制訂，增加了牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量等檢測項(xiàng)目。本原則分為細(xì)胞培養(yǎng)基檢查項(xiàng)目和每個項(xiàng)目的檢查辦法兩部分，為評判細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品質(zhì)量提供了根據(jù)和辦法，從而規(guī)范我國細(xì)胞培養(yǎng)基行業(yè)健康發(fā)展。成果評定根據(jù)本原則和辦法對細(xì)胞培養(yǎng)基樣品進(jìn)行全項(xiàng)檢查，全部項(xiàng)目均符合原則規(guī)定，鑒定該樣品為合格；若有一項(xiàng)不符合原則規(guī)定，則鑒定樣品為不合格。細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量原則及檢查辦法細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量原則細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量應(yīng)符合表1所示的技術(shù)規(guī)定。表1技術(shù)規(guī)定檢查項(xiàng)目程度規(guī)定檢查辦法澄清度澄清中華人民共和國藥典二部附錄ⅨB進(jìn)行。pH值（每升標(biāo)示量/L）pH允許偏差范疇為±0.30中華人民共和國藥典附錄ⅥH進(jìn)行。滲入壓（mOsm/kgH2O）滲入壓允許偏差范疇為±5％中華人民共和國藥典二部附錄ⅨG滲入壓摩爾濃度測定法進(jìn)行。干燥減量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）≤5.0按中華人民共和國藥典二部附錄ⅧL干燥失重測定法進(jìn)行。細(xì)菌內(nèi)毒素（EU/ml）≤10按中華人民共和國藥典附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進(jìn)行。微生物程度細(xì)菌數(shù)（CFU/g）≤200按中華人民共和國藥典附錄ⅪJ微生物程度檢查法進(jìn)行，檢查項(xiàng)目為細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)。檢查法采用平皿法。霉菌數(shù)（CFU/g）≤50細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)（vero細(xì)胞）細(xì)胞形態(tài)成纖維樣貼壁生長，形態(tài)正常無變異按中華人民共和國化工行業(yè)原則《哺乳類動物細(xì)胞培養(yǎng)基》HG/T3935-第7.7條進(jìn)行。細(xì)胞數(shù)量培養(yǎng)72h細(xì)胞數(shù)量不低于1×105cells/ml；繼續(xù)維持48h細(xì)胞數(shù)量不低于1×105cells/ml牛血清白蛋白不得檢出根據(jù)中華人民共和國藥典三部附錄ⅧI牛血清白蛋白殘留量測定法進(jìn)行，不得檢出牛血清白蛋白?？股夭坏脵z出根據(jù)中華人民共和國藥典三部附錄ⅨA抗生素殘留量測定法進(jìn)行，不得檢出青霉素、鏈霉素及慶大霉素。檢查辦法除非另有闡明，檢查中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和中華人民共和國藥典中規(guī)定的純化水。2.1澄清度的測定稱取每升標(biāo)示量的實(shí)驗(yàn)室樣品，置于1000ml燒杯中，加水950ml，攪拌至溶解，補(bǔ)加水至1000ml,攪拌均勻。按中華人民共和國藥典二部附錄ⅨB進(jìn)行。2.2pH值的測定稱取每升標(biāo)示量的實(shí)驗(yàn)室樣品，置于1000ml燒杯中，加水950ml，攪拌至溶解，補(bǔ)加水至1000ml,攪拌均勻。按中華人民共和國藥典三部附錄ⅤA進(jìn)行。2.3干燥減量的測定按中華人民共和國藥典三部附錄ⅦL干燥失重測定法進(jìn)行。2.4滲入壓的測定稱取每升標(biāo)示量的實(shí)驗(yàn)室樣品，置于1000ml燒杯中，加水950ml，攪拌至溶解，補(bǔ)加水至1000ml,攪拌均勻。按中華人民共和國藥典三部附錄ⅤH滲入壓摩爾濃度測定法進(jìn)行。取兩次平行測定成果的算術(shù)平均值為測定成果，兩次平行測定成果的絕對差值不不不大于這兩個測定值的算術(shù)平均值的5%。2.5細(xì)菌內(nèi)毒素的測定按中華人民共和國藥典三部附錄ⅫE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進(jìn)行。2.6微生物程度的測定按中華人民共和國藥典三部附錄ⅫG微生物程度檢查法進(jìn)行，檢查項(xiàng)目為細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)。檢查法采用平皿法。2.7細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)2.7.1貼壁型細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)2.7.1.1辦法提綱1)本實(shí)驗(yàn)所用容器具及溶液均為無菌，實(shí)驗(yàn)操作過程均為無菌操作。2)細(xì)胞在37℃恒溫條件下，在含體積分?jǐn)?shù)3%或10%的小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中生長72h，觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；細(xì)胞生長72h后，更換不含小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。2.7.1.2試劑和材料1)牛血清：符合中華人民共和國藥典三部附錄ⅩⅢD。2)平衡鹽溶液：稱取氯化鉀0.2g，精確至0.01g；無水磷酸二氫鉀0.2g，精確至0.01g；氯化鈉8.0g，精確至0.01g；無水磷酸氫二鈉1.15g，精確至0.001g；加純化水1000ml，混勻，測pH值，pH值應(yīng)在7.5±0.3，過濾除菌即得。3)細(xì)胞：vero細(xì)胞（或根據(jù)不同的細(xì)胞培養(yǎng)基種類選擇適應(yīng)的細(xì)胞):細(xì)胞代次不超出150代。4)細(xì)胞培養(yǎng)液：按產(chǎn)品使用闡明書規(guī)定配制；3)胰蛋白酶溶液：稱取胰蛋白酶（1:250）2.5g，精確至0.01g，加1000ml平衡鹽溶液，混勻、測pH值，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)pH值7.6～7.8，過濾除菌即得。2.7.1.3儀器1）醫(yī)用凈化工作臺：干凈級別為百級.2）二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱：能通二氧化碳?xì)怏w并且保持二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為（5±0.1）％，能在（37±1）℃恒溫。3）細(xì)胞培養(yǎng)瓶：T25型、無菌。4）顯微鏡：倒置、相差。5）血球計(jì)數(shù)板。6）蓋玻片：無水乙醇浸泡并擦干。2.7.1.4實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)1）制備細(xì)胞懸液A取長成致密單層的細(xì)胞種子，將原細(xì)胞培養(yǎng)液從細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)吸出，用適量平衡鹽溶液洗細(xì)胞一次，棄洗液（去除死細(xì)胞）。B向細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶溶液1ml，消化一定時間，在顯微鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞變圓靠近脫壁時，將胰蛋白酶溶液倒掉。C根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入一定量細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打，使細(xì)胞脫壁制成細(xì)胞懸液A。2)細(xì)胞培養(yǎng)A吸取一定量的細(xì)胞懸液A，加到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。B向細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加至10ml含體積分?jǐn)?shù)為3%或10%的小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，使細(xì)胞接種數(shù)量為5×104細(xì)胞/ml。C將細(xì)胞培養(yǎng)瓶送入培養(yǎng)箱，在（37±1）℃溫度條件及（5±0.1）％二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)。D培養(yǎng)72h，觀察細(xì)胞形態(tài)，按照2.7.1.4環(huán)節(jié)1）辦法制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。E培養(yǎng)72h后，更換不含牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液10ml，繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察細(xì)胞形態(tài)，按照2.7.1.4實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)1）辦法制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。3)細(xì)胞計(jì)數(shù)A將需要計(jì)數(shù)的細(xì)胞按按照2.7.1.4環(huán)節(jié)1）辦法制備細(xì)胞懸液B。B吸取細(xì)胞懸液B100μl轉(zhuǎn)移至離心管中，視細(xì)胞量擬定與否稀釋及稀釋倍數(shù)。C將蓋玻片蓋于計(jì)數(shù)板中心的計(jì)數(shù)室上方。調(diào)節(jié)計(jì)數(shù)板中的細(xì)胞數(shù)量在（100～300）個。沿蓋玻片邊沿點(diǎn)加細(xì)胞懸液使其通過毛細(xì)作用自然滲入，不要留有氣泡，不要外溢，顯微鏡下計(jì)數(shù)。D觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞壓中線時，普通遵照“計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上不計(jì)下”的原則。將計(jì)數(shù)板觀察細(xì)胞數(shù)代入下列公式：計(jì)數(shù)板觀察細(xì)胞數(shù)×104×稀釋倍數(shù)/4＝細(xì)胞數(shù)/ml2.7.1.5分析成果的表述培養(yǎng)72h的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)應(yīng)正常，活細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)成1×105個/ml以上。繼續(xù)維持培養(yǎng)48h的細(xì)胞形態(tài)應(yīng)正常，活細(xì)胞數(shù)量應(yīng)不不大于1×105個/ml以上。2.7.2懸浮型細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)2.7.2.1辦法提綱本實(shí)驗(yàn)所用容器具及溶液均為無菌，實(shí)驗(yàn)操作過程均為無菌操作。細(xì)胞在37℃2.7.2.2試劑和材料1）細(xì)胞：已適應(yīng)待檢細(xì)胞培養(yǎng)基的懸浮細(xì)胞株。2）細(xì)胞培養(yǎng)液：按產(chǎn)品使用闡明書規(guī)定配制；2.7.2.3儀器1）醫(yī)用凈化工作臺：干凈級別為百級；2）恒溫震蕩培養(yǎng)箱：能在（37±1）℃恒溫；3）細(xì)胞培養(yǎng)瓶：250ml搖瓶，應(yīng)無菌；4）顯微鏡：倒置、相差；2.7.2.4細(xì)胞培養(yǎng)1）用方瓶或搖瓶擴(kuò)增細(xì)胞；2）離心細(xì)胞，用待測細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，計(jì)算出所需要的細(xì)胞數(shù)；3）將細(xì)胞轉(zhuǎn)至搖瓶中，細(xì)胞數(shù)量接種數(shù)量為2.5×105個/ml，加液量20ml左右；4）將搖瓶細(xì)胞移至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速90～100rpm，溫度37℃5）培養(yǎng)72h，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量和活率（采用0.4%的臺盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)及計(jì)算活率）。2.7.2.5細(xì)胞活率計(jì)算1）細(xì)胞染色：取吸管1支，伸入培養(yǎng)瓶中，輕輕重復(fù)吹打細(xì)胞懸液使細(xì)胞重懸均勻后，立刻吸細(xì)胞懸液少量，向另一離心管中滴入細(xì)胞懸液1份，再滴入臺盼藍(lán)染液1份，混勻，置2～3分鐘。2）計(jì)數(shù)：按2.7.1.4環(huán)節(jié)1）進(jìn)行。鏡下觀察可見細(xì)胞分散各處，健康細(xì)胞胞體完整，透明不著色，凡著色細(xì)胞均為死細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)。3）活率計(jì)算細(xì)胞活率%=（活細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)）×100%2.