豬精液冷凍及xy精子分離技術(shù)的應(yīng)用

豬精液冷凍及xy精子分離技術(shù)的應(yīng)用

20世紀(jì)30年代，人們開(kāi)始在豬上使用人工產(chǎn)品，但這一真正的發(fā)展和廣泛應(yīng)用于豬業(yè)的養(yǎng)豬業(yè)。在20世紀(jì)末世界范圍內(nèi)接近50%的母豬都是通過(guò)人工授精受孕的,且這個(gè)比例還在逐年上升。在一些歐洲國(guó)家,如比利時(shí)、意大利、荷蘭、挪威和西班牙,超過(guò)80%的母豬是人工授精,在北美(美國(guó)、加拿大和墨西哥)和巴西的大型農(nóng)場(chǎng)這個(gè)比例已經(jīng)接近75%。目前,世界上每年大約有2500萬(wàn)頭次豬進(jìn)行人工授精。其中,超過(guò)99%的授精使用的是儲(chǔ)存在15℃~20℃下,最多保存3d的液態(tài)冷藏精液。發(fā)情期輸精2~3次,每次超過(guò)25億精子,將80~100mL的大量精液輸入到子宮頸內(nèi),受孕率達(dá)80%~90%,與自然交配的產(chǎn)仔率和產(chǎn)仔數(shù)相當(dāng),甚至更高。此外,近1%的授精使用的是劑量在50億~60億精子的冷凍、解凍精液,不僅每次輸精需要高劑量精子,而且受孕率也低于冷藏精液。在最好的繁育管理?xiàng)l件下也只有大約70%受孕率。豬冷凍精液和性別控制精液正在試驗(yàn)推廣中,而以精子載體的轉(zhuǎn)基因(SMGT)、精子膠囊和精子凍干技術(shù)將在未來(lái)幾年內(nèi)得到發(fā)展。這些技術(shù)被養(yǎng)豬業(yè)接受和采用的速度取決于他們?cè)趹?yīng)用中的效率。由于每次需要大量的精子,現(xiàn)今子宮頸內(nèi)授精方式在實(shí)現(xiàn)效率上受到限制。在一些這類新技術(shù)中,比如以性別分離精子為例,在分選后可用的精子非常少。因此,有效的商業(yè)應(yīng)用需要的輸精方式,應(yīng)該能夠在輸入低精子數(shù)量情況下獲得正常的繁殖率。1精子有效供給的量子宮頸內(nèi)授精包括很大數(shù)量的精子(約25億)輸進(jìn)子宮頸后部的皺褶。大多數(shù)的母豬在輸精時(shí)和以后表現(xiàn)出精液逆流。因而,大約30%~40%輸入子宮頸管的精子,在授精后1h內(nèi)從管中流出。同時(shí),超過(guò)90%的精子在授精后2~3h內(nèi)被母豬的生殖系統(tǒng)-子宮頸、子宮輸-卵管連接部、輸卵管壺峽連接部篩選排斥。這種大量的流失限制了能夠到達(dá)子宮輸卵管連接處的精子數(shù)。向成年母豬授精30億冷藏精子,只有大約10萬(wàn)成功的達(dá)到了子宮輸卵管連接處,大約1000個(gè)精子到達(dá)了輸卵管峽部的精子儲(chǔ)存庫(kù)。此外,在精子質(zhì)量差時(shí)損失更為嚴(yán)重,比如冷凍-解凍精子。實(shí)際上,在輸卵管中有效冷凍-解凍精子的數(shù)量一般比冷藏精子低十倍。因此,將精液輸?shù)阶訉m頸后更深部位能夠允許更多的精子到達(dá)子宮輸卵管連接部是更合理的,甚至與子宮頸內(nèi)授精相比使用更少的精子。2將精子直接加入臟器中,確保產(chǎn)仔率有效的授精方式是保證在盡可能少的精子輸入后有足夠數(shù)量的精子進(jìn)入輸卵管-子宮連接部,保證正常的產(chǎn)仔率與產(chǎn)仔數(shù)。因此,要從精子液態(tài)保存精液和冷凍精液人工授精,探討授精方式的實(shí)用性。2.1因需而進(jìn)的精子密度的確定冷藏精液輸精效果令人滿意,但每次需要大量精子。這就降低了良種的公豬生產(chǎn)的精液的效率和利用。而且,當(dāng)精液的數(shù)量有限而大量的母豬需要授精時(shí),精液來(lái)源可能出現(xiàn)困難。因此,養(yǎng)豬者對(duì)于在不降低繁殖率的同時(shí)減少每次輸精需要的精子數(shù)量很感興趣。為實(shí)現(xiàn)目前常規(guī)的子宮頸內(nèi)授精滿意的產(chǎn)仔率和胎產(chǎn)仔數(shù),要求一次輸精劑量超過(guò)25億個(gè)精子。而當(dāng)子宮頸授精數(shù)量每次低于25億個(gè)精子時(shí),產(chǎn)仔率和胎仔數(shù)不能令人滿意。因此,選擇的合適授精方式是為了實(shí)現(xiàn)減少每次輸精的精子數(shù)。最近提出2項(xiàng)新的不同授精方式,即子宮頸后授精和子宮深部授精技術(shù),這2種方式都包括把精液直接輸入子宮內(nèi)。子宮頸后授精是將精液輸?shù)阶訉m體,而子宮深部授精是將輸?shù)阶訉m角的近端1/3處。2.1.1精子需使用在精子患者中的數(shù)量子宮頸后授精,使用的是一個(gè)細(xì)的和半軟的輸精裝置通過(guò)一個(gè)事先插入子宮頸皺褶的常規(guī)導(dǎo)尿管。因?yàn)樘厥獾妮斁b置比常規(guī)輸尿管長(zhǎng)15~20cm,它可以通過(guò)子宮頸皺褶進(jìn)入子宮體。Waston&Behan(2002)在英國(guó)每次使用10億精子通過(guò)子宮頸后授精技術(shù)給3240只經(jīng)產(chǎn)母豬輸精,產(chǎn)仔率為88.7%,胎仔數(shù)為12.1只,與子宮頸內(nèi)授精的產(chǎn)仔率91.3%,胎仔數(shù)12.5個(gè)相比無(wú)顯著差異。然而,Roberts&Bilkei(2005)在匈牙利和克羅地亞對(duì)1783只經(jīng)產(chǎn)母豬分別使用10億精子子宮頸后授精和30億精子子宮頸內(nèi)授精,盡管2者在產(chǎn)仔率上相似,但子宮頸后授精的母豬胎產(chǎn)數(shù)卻明顯少(前者10.2只,后者12.3只),這些結(jié)果與Rozeboom等(2004)于美國(guó)研究報(bào)道一致。當(dāng)嘗試更少輸精數(shù)量時(shí),即每次輸精5億精子,產(chǎn)仔率和胎仔數(shù)更低。因此,子宮頸后授精方式直接把每次10億精子輸入子宮體可獲得正常的產(chǎn)仔率,但胎產(chǎn)仔數(shù)可能下降。使用子宮頸后授精可以減少精子數(shù)量而不會(huì)減少產(chǎn)仔率的2個(gè)主要原因是半軟授精裝置越過(guò)子宮頸皺褶,同時(shí)精液逆流減少20%。然而,每胎產(chǎn)仔數(shù)減少的原因還不清楚。而Roberts&Bilkei(2005)認(rèn)為是非正規(guī)的授精造成的,因?yàn)槿鄙賹?duì)使用子宮頸后授精裝置操作的訓(xùn)練。一些其他原因,如老化的精子,操作不當(dāng)或者輸精與排卵時(shí)間間隔,在使用較少的精子數(shù)量時(shí)都會(huì)導(dǎo)致繁殖率下降。此外,在當(dāng)前生產(chǎn)條件下使用子宮頸后授精,10億輸精數(shù)量似乎不能達(dá)到正常繁殖率。因此,為了獲得高繁殖率,應(yīng)該考慮增加輸精數(shù)量。2.1.2規(guī)過(guò)胎產(chǎn)仔數(shù)子宮深部授精方式包括通過(guò)一個(gè)事先插入子宮頸皺褶用作向?qū)У某Ｒ?guī)授精輸尿管,把一個(gè)柔韌纖細(xì)的裝置導(dǎo)入一個(gè)子宮角。子宮深部授精裝置能夠順著子宮腔前進(jìn),使精液容易輸入子宮角近端1/3處。Vazquez等(2001)在西班牙對(duì)329只經(jīng)產(chǎn)母豬使用子宮深部授精(1.5億精子/次)一次、2次或3次以及子宮頸內(nèi)授精(30億精子/次),產(chǎn)仔率為83.3%~87.3%,胎產(chǎn)仔數(shù)在9.2~10.4個(gè),雖然2種授精方式間無(wú)統(tǒng)計(jì)差異,子宮深部授精的胎仔數(shù)總是最低的。Day等(2003)在美國(guó)對(duì)105只經(jīng)產(chǎn)母豬分別采用2次子宮深部授精1.5億精子或者子宮頸內(nèi)授精30億精子,雖然在產(chǎn)仔率(子宮深部授精83%,子宮頸內(nèi)授精90%)上沒(méi)有差異,但子宮深部授精的母豬每胎產(chǎn)子豬數(shù)較少(前者10.5只,后者12.9只)。從2個(gè)研究中結(jié)果可以推測(cè),胎仔數(shù)的下降可以通過(guò)增加每次授精的精子數(shù)克服。與子宮頸內(nèi)授精相比,子宮頸后授精和子宮深部授精方式可以減少每次對(duì)冷藏精子數(shù)目的需要。達(dá)到子宮頸內(nèi)授精(30億精子每次)的受精效果,可以期待由每次輸精1~1.5億(子宮頸后授精)或6億(子宮深部授精)得到。因此,這2種方式都可以被視為接近在生產(chǎn)條件下使用冷藏精液的實(shí)用、有效的授精方式。特別是在精源有限或者高質(zhì)量的種公豬的精液需要被盡可能有效的使用情況下。但該技術(shù)中將輸精管準(zhǔn)確的插入到子宮及子宮深部需要培訓(xùn)和練習(xí)。授精后陰門出現(xiàn)的血液很可能與外傷有關(guān),應(yīng)該是對(duì)裝置的不正確操作所致。同時(shí),利用該技術(shù)給初配豬授精要慎重,因?yàn)槭寡b置通過(guò)小豬子宮頸比較困難。2.2不同的授精方式對(duì)子犯精子的應(yīng)用在大型種公豬場(chǎng)使用冷凍精液人工授精,充分利用優(yōu)秀種公豬的遺傳潛力很有必要。然而,冷凍精液在世界范圍內(nèi)的人工授精中應(yīng)用不到1%。冷凍解凍精液子宮頸內(nèi)授精獲得繁殖率低于冷藏精液,同時(shí)每次授精需要的大量精子,這就限制了冷凍精液在養(yǎng)豬業(yè)世界范圍內(nèi)的商業(yè)化應(yīng)用。目前,豬凍精人工授精一般每次采用50~60億精子的大劑量子宮頸內(nèi)授精,但受孕率與產(chǎn)仔率都很低,這可能與子宮頸內(nèi)授精方式的低效有關(guān)。同時(shí),冷凍-解凍精液品質(zhì)下降,冷凍-解凍精子通過(guò)子宮頸褶,進(jìn)入子宮到達(dá)子宮輸卵管連接處更加困難,導(dǎo)致在輸卵管峽部不能儲(chǔ)存足夠的精子。當(dāng)然,使用冷凍-解凍精子與液態(tài)保存精子相比,胚胎透明帶附著的精子數(shù)量大約少10倍左右,輸精的精子數(shù)量前者比后者要多2倍。因此,冷凍-解凍精子的有效應(yīng)用需要在授精方式上改進(jìn)。無(wú)論子宮頸后授精還是子宮深部授精都應(yīng)該是改善冷凍-解凍精子受精產(chǎn)仔效果的比較適合的授精方式。這2種授精方式應(yīng)能抵消冷凍-解凍精子在商業(yè)農(nóng)場(chǎng)中常規(guī)應(yīng)用的限制因素,即每次需要的大量精子和得到的低受精率。此外,這2種授精方式適合商業(yè)化應(yīng)用,尤其是農(nóng)戶使用。在西班牙、澳大利亞和瑞典完成的不同的報(bào)告證明了這一點(diǎn)。Bolarin等(2006)研究了自發(fā)排卵母豬(n=407),強(qiáng)調(diào)每次授精只使用10億冷凍-解凍精子的效果。當(dāng)接近排卵時(shí)間(超聲波檢查)時(shí)采取子宮深部授精,獲得超過(guò)80%的產(chǎn)仔率和胎產(chǎn)仔數(shù)也超過(guò)10只。并強(qiáng)調(diào)重視發(fā)情排卵時(shí)間確定在更精確時(shí)間授精以得到最高受精率的重要性。此外,Wongtawan等(2006)建議使用冷凍-解凍精子子宮深部授精應(yīng)該在自發(fā)排卵前4~8h進(jìn)行。在人工授精方式中冷凍-解凍精子的受精成功率取決于人工授精的排卵的時(shí)間間隔。目前,預(yù)測(cè)排卵時(shí)間的方法受限于平均發(fā)情持續(xù)時(shí)間的評(píng)估,因?yàn)樽园l(fā)排卵在發(fā)情后發(fā)情期的3分之二時(shí)發(fā)生。因此,建議常規(guī)繁育管理的養(yǎng)豬戶使用凍精授精時(shí)增加子宮深部授精每次劑量的冷凍-解凍精子數(shù)?？傊?子宮深部授精方式有使用最少10~20億冷凍-解凍精子實(shí)現(xiàn)高受精率的潛力。2.3精子在臟器外科手術(shù)中的應(yīng)用通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行X、Y精子分離技術(shù)是基于DNA含量的相對(duì)差可以鑒別含X或Y染色體的精子,并且受精前確定后代的性別。精子由熒光染料(Hoechst33342)染色,染料穿入精子頭部細(xì)胞膜與DNA結(jié)合。因?yàn)閅染色體比較大的X染色體偏小并攜帶更少的DNA,精細(xì)胞在激光下曝光表現(xiàn)出2種不同的熒光強(qiáng)度并可通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量。目前,借助高速分離系統(tǒng),每分鐘能鑒別超過(guò)2萬(wàn)個(gè)精細(xì)胞,1h內(nèi)超過(guò)1500萬(wàn)精子能夠被性別分離,超過(guò)85%的純度。因此,每24h能得到3.6億性別分離的精子。性控精子通過(guò)外科手術(shù)授精生產(chǎn)了第一只小豬。給126只母豬(n=126)子宮深部授精每次至少5000萬(wàn)精子,產(chǎn)仔率超過(guò)75%和胎仔數(shù)9只。Vazquez等(2003)報(bào)告激素處理46只經(jīng)產(chǎn)母豬,一次授精最少5000到7000萬(wàn)新鮮性控精子,產(chǎn)仔率達(dá)到40%。但每次授精所需精子數(shù)量還是太大,以致不能認(rèn)為子宮深部授精對(duì)性控精液是一種有效的授精方式。最近,研究顯示最少1000萬(wàn)冷藏精子通過(guò)外科手術(shù)植入子宮輸卵管結(jié)合部即可得到高的受孕率(89%)。雖然,手術(shù)衛(wèi)生嚴(yán)格,但外科剖腹手術(shù)不被認(rèn)為是養(yǎng)豬場(chǎng)母豬授精的實(shí)用方式,一種可選擇的方法是腹腔鏡法。比起剖腹手術(shù)把精液直接輸入子宮,腹腔鏡法是一種創(chuàng)傷較小的手術(shù),并且可在大的養(yǎng)殖場(chǎng)培訓(xùn)推廣。在意大利完成的一項(xiàng)近期試驗(yàn),Fantinati等(2005)通過(guò)腹腔鏡把精子輸入接近子宮輸卵管連接處,達(dá)到高受精率所需的冷藏精子數(shù)量可以減少至每個(gè)子宮角500萬(wàn)個(gè)精子。這種腹腔鏡技術(shù)已經(jīng)被證明可用于性控精液輸精。最近報(bào)道,使用腹腔鏡法每個(gè)子宮角最少30萬(wàn)個(gè)性別分離精子,受孕率可達(dá)到80%。此外,近來(lái)的研究也證明必須在排卵前輸精才可獲得最高的繁殖率,因?yàn)樾詣e分離精子在雌