三種消化酶測定

蛋白酶活力的測定[目的與原理]掌握蛋白酶活力的測定方法，測定魚、蝦、貝等水產(chǎn)動物主要消化器官肝胰臟、胃、腸等蛋白酶的活力。動物消化器官內(nèi)含有各種消化腺，這些消化腺分泌消化酶進(jìn)行化學(xué)性消化作用，將機(jī)體攝入的大分子營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄孕》肿游镔|(zhì)而吸收進(jìn)入血液循環(huán)。本實驗采用福林—酚法測定機(jī)體內(nèi)主要消化酶—蛋白酶活力。福林—酚試劑（Folinphenol）在堿性溶液中極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原為藍(lán)色化合物。蛋白質(zhì)中含有酚基的氨基酸包括（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用蛋白酶分解酪蛋白（底物），生成含酚基的氨基酸與福林－酚試劑成藍(lán)色反應(yīng)，可從藍(lán)色的深淺測知酶活力多少。[試劑與器材]試劑：1、福林試劑：在2000ml磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100g，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g，水700ml，35％磷酸50ml，濃鹽酸100ml，文火回流10小時，然后加人硫酸鋰50g，水50ml和溴水?dāng)?shù)滴，搖勻，去除冷凝器，繼續(xù)煮沸15分鐘，以除去多余的溴。溶液呈金黃色，冷卻后，定容至1000ml，過濾，濾液即福林試劑（試劑不應(yīng)呈綠色，否則需重配）。置于棕色瓶中保存，使用時用氫氧化鈉標(biāo)定，稀釋至1N。2、0.55M碳酸鈉溶液3、10％三氯乙酸4、0.02MpH7.5磷酸緩沖液：0.02M磷酸氫二鈉溶液的配制：取Na2HPO4·2H2O3.561g(或Na2HPO412H2O

7.164g)，溶解于1L蒸餾水中。0.02M磷酸二氫鈉溶液的配制：取NaH2PO4H2O

2.76g(或NaH2PO42H2O3.121g)，溶解于1L蒸餾水中。將0.02M磷酸氫二鈉溶液84ml與0.02M磷酸二氫鈉溶液16ml混合，即為0.02MpH7.5磷酸緩沖液。5、0.5％酪素：（酪蛋白）0.5克，以0.5NNaOH1ml濕潤。再加少量0.02MpH7.5磷酸緩沖液稀釋。在熱水浴中溶解，定容至100ml，冰箱中可保存一周。材料：鮮活魚、蝦、貝的肝胰臟、胃、腸標(biāo)本。器材：分光光度計、光徑1.0cm比色杯、離心管、電子天平、離心機(jī)、勻漿器、剪子、鑷子、冰塊、試管若干、移液管若干。[實驗步驟]1、酶粗提液的制備取新鮮肝胰臟、胃、腸組織稱重，在冰盤上剔除脂肪及內(nèi)容物，以10倍緩沖液或去離子水勻漿各組織，將組織懸液低溫下離心（3000rpm/min）,上清液為酶粗提液（酶液）。2、酶活力測定（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N鹽酸溶解，定容至100ml，分別配制溶液0—100μg/ml不同濃度溶液，不同濃度各取酪氨酸溶液1ml，加0.5％酪素2ml，于370C水浴中反應(yīng)15分鐘，然后加入三氯乙酸3ml，離心除去沉淀。取清液1ml，加入0.55M碳酸鈉5ml，再加入福林試劑1ml，于（2）樣品測定樣品測定設(shè)對照管和測定管。

對照管

測定管適當(dāng)稀釋酶溶液

/

1ml去離子水

1ml

/

3700.5酪素（預(yù)熱過）

2ml

2ml

37010％三氯乙酸

3ml

3ml離心去除沉淀取上清液于另外試管內(nèi)

1ml

1ml0.55M碳酸鈉

5ml

5ml福林試劑

1ml

1ml37℃3、計算在37℃蛋白酶的活力單位＝A/15×FA為樣品測得光密度查曲線，得相應(yīng)酪氨酸μg數(shù)F為酶液最終稀釋倍數(shù)，15為反應(yīng)時間（min）將兩管在37℃酶液—0.1ml測定管混勻后，再置37℃0.01N碘應(yīng)用液5.0ml5.0ml

用蒸餾水稀釋至50ml，立即混勻。用660nm或紅色濾光板進(jìn)行比色，以蒸餾水校正光密度0點，讀取對照管和測定管光密度讀數(shù)。3、計算淀粉酶活力單位定義：在370淀粉酶活力單位/100ml＝（對照管光密度—測定管光密度）/對照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=（對照管光密度—測定管光密度）/對照管光密度×800[方法評估]測定淀粉酶的方法有很多種，大致可分為兩類：即測定底物（淀粉）的減少量和測定產(chǎn)物（如還原性糖）的生成量。本實驗采用前者的淀粉—碘比色法。[應(yīng)用意義]分析淀粉酶的活力有助于了解水產(chǎn)動物對食物中淀粉的消化能力，由于魚蝦等水產(chǎn)動物種類與大小的差異和所提供食物品質(zhì)的不同，以及動物所處生活環(huán)境的變化，各種水產(chǎn)動物對食物的消化吸收有明顯的差別。認(rèn)識魚蝦消化酶變化特性，為研究水產(chǎn)種類飼料配伍提供科學(xué)依據(jù)[注意事項]1、0.04%可溶性淀粉溶液5ml內(nèi)含淀粉量為2mg，在本法條件下，當(dāng)2mg淀粉完全水解時相當(dāng)于800淀粉酶單位／100ml（即：2/10×30/7.5×100/0.1=800）。2、對照管內(nèi)含淀粉2mg，由于淀粉溶液比較穩(wěn)定，故對照管在固定比色計上的光密度讀數(shù)并不改變，因而在測定中不必每次作對照管。3、當(dāng)?shù)矸勖附咏?00單位時，由于淀粉已幾乎完全被水解，故加入碘液后也不再顯藍(lán)色，因此淀粉酶單位較高時（接近600單位）宜將標(biāo)本稀釋（2～5倍）后重新測定，并將測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。4、如淀粉溶液出現(xiàn)混濁或絮狀物，表示淀粉溶液污染或變質(zhì)，不能再用。5、唾液內(nèi)含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飛沫污染，也能使測定結(jié)果顯著偏高。脂肪酶活力的測定[目的與原理]掌握脂肪酶活力的測定方法，并測定魚、蝦、貝體內(nèi)消化器官肝胰臟、胃、腸的脂肪酶活力。脂肪酶在一定條件下，將甘油三酯水解。在不同水解階段可分別產(chǎn)生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。水解所產(chǎn)生的脂肪酸可以用標(biāo)準(zhǔn)的氫氧化鈉滴定，用滴定值表示酶活力。[試劑與器材]試劑：1、聚乙烯醇(P.V.P.)橄欖油乳化液：稱取40克聚乙烯醇，加蒸餾水約1000毫升，在小火上加熱，并不停攪拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷卻后定容至1000毫升。用雙層紗布過濾，濾液備用。取4％聚乙烯醇溶液150毫升，加50毫升橄欖油，用高速組織搗碎機(jī)攪動6分鐘，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液，保存于低溫下（4℃2、0.025M磷酸緩沖液（pH7.5）。0.025M磷酸氫二鈉溶液的配置：取Na2HPO4·2H2O4.45g溶于1L蒸餾水中，0.025M磷酸二氫鈉溶液的配置：取NaH2PO4·H2O3.45g（或NaH2PO4·2H2O3.90g）溶于1L蒸餾水中。將0.025M磷酸氫二鈉84ml與0.025M磷酸二氫鈉16ml混合，即為0.025M磷酸緩沖液。3、0.05N氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液4、1％酚酞指示劑：取1g酚酞溶于100ml70％乙醇溶劑中。5、95％乙醇材料：魚、蝦、貝的肝胰臟、胃、腸標(biāo)本。器材：勻漿器、離心機(jī)、恒溫水浴。高速組織搗碎機(jī)、酸式滴定管、滴定管架、鑷子、剪子、錐形瓶、移液管、燒杯。[實驗步驟]1、酶粗提液的制備（見蛋白酶活力的測定）。2、取100ml錐形瓶3個，一個作為對照組，另兩個為測定組

對照組

測定組1

測定組20.025M磷酸緩沖液（pH7.5）

5ml

5ml

5ml聚乙醇橄欖油乳化液

4ml

4ml

4ml95％乙醇

15ml

40℃酶液

1ml

1ml

1ml

40℃95％乙醇

—

15ml

15ml酚酞指示劑

3滴

3滴

3滴

用0.05N標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定至微紅色，記錄滴定用去ml數(shù)。計算：酶活力以國際單位表示，即在一定條件下，脂肪酶水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1微克分子脂肪酸的酶量定為一個國際單位。

脂肪酶活力單位＝（A－B）N·f

t式中：A為樣品耗堿液ml數(shù)，

B為對照組耗堿液ml數(shù)N為每毫升堿液微克分子數(shù)，f為稀釋倍數(shù)t為作用時間(分)[方法評估]測定脂肪酶活力的方法大致可分為3類：即測定產(chǎn)物（游離脂肪酸）的增加量（如滴定法、比色法、分光光度法、熒光法和pH電極法等）；測定底物的減少量（如比濁法、擴(kuò)散法等）；測定脂酶的實際量（如放射免疫法和乳膠凝集法等）。本實驗用滴定法測定脂肪酶活力，此法靈敏度較差，樣品用量大，但所需設(shè)備較簡單，可隨時進(jìn)行檢測。[應(yīng)用意義]脂肪酶是動物消化脂肪的重要酶類其分泌量和活力與動物對脂肪的消化、吸收