白腐真菌木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)量和控制研究

白腐真菌木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)量和控制研究

木質(zhì)素分解酶的實(shí)際生產(chǎn)取決于成熟生物器的發(fā)酵技術(shù)。生物器官發(fā)酵是木質(zhì)素分解酶研究中的一個(gè)重要因素。目前，白腐真菌木質(zhì)素分解酶的生物過(guò)程主要采用兩種類(lèi)型的培養(yǎng)方法：c型、體積小、固定化和細(xì)胞。然而，從文獻(xiàn)的角度來(lái)看，關(guān)于白腐真菌反應(yīng)的發(fā)酵技術(shù)還不成熟。1988年，danshokar等人申請(qǐng)了42l混音器，以研究p.chysos類(lèi)固醇的懸浮培養(yǎng)和木質(zhì)素分解酶。我們驗(yàn)證了感染的數(shù)量、細(xì)菌的大小、一些有機(jī)化合物、培養(yǎng)條件和基質(zhì)成分的影響，并首次證明了布局中木質(zhì)素分解酶的大規(guī)模分解。在氣升裝置中，采用不規(guī)則鋼網(wǎng)固定化培養(yǎng)p.chysos類(lèi)固醇生產(chǎn)mnm。當(dāng)器規(guī)模從2.5m擴(kuò)大到100ml時(shí)，mnm的產(chǎn)量增加了兩倍，達(dá)到6600u。bosa等人的應(yīng)用直徑為50cm高的濾床床裝置用于研究表觀(guān)液體速度對(duì)p.chysos類(lèi)固醇類(lèi)重酶活性。結(jié)果表明，表觀(guān)液體速度影響lip的產(chǎn)生和活性，0.020.04cms-1表觀(guān)液體速度可顯著提高lip的活性。研究了康格等人開(kāi)發(fā)的一種新的鼓帽反應(yīng)裝置p.chysos類(lèi)固醇的分解，并得出結(jié)論，半晶態(tài)發(fā)酵有利于m公共財(cái)政和lip。此外，還申請(qǐng)了一種氣升裝置來(lái)訓(xùn)練p.chysos類(lèi)固醇，并研究了自由懸浮培養(yǎng)和固定緩沖固定劑對(duì)木質(zhì)素分解酶的影響。由于木質(zhì)素降解酶往往是在白腐真菌受碳、氮或硫營(yíng)養(yǎng)限制的次生代謝階段產(chǎn)生的,在生長(zhǎng)受限制時(shí),酶產(chǎn)率也較低.因此,為了克服底物的阻遏效應(yīng),人們嘗試采用底物流加策略進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵以進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量和產(chǎn)率.Moreira等在10L攪拌罐反應(yīng)器中培養(yǎng)Bjerkanderasp.BOS55時(shí),發(fā)現(xiàn)分批補(bǔ)料方式能夠重新激活酶的產(chǎn)生,使酶活維持較長(zhǎng)時(shí)間.Galhaup等采用20L攪拌罐生物反應(yīng)器培養(yǎng)TrametespubescensMB89生產(chǎn)漆酶(Lac),在分批培養(yǎng)中最大Lac活力約為330U/mL,通過(guò)采用分批補(bǔ)料策略控制反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖濃度不超過(guò)某一低的臨界值,從而避免葡萄糖抑制效應(yīng),使得Lac產(chǎn)量幾乎達(dá)到分批培養(yǎng)的2倍(740U/mL).目前我國(guó)應(yīng)用生物反應(yīng)器研究白腐真菌發(fā)酵技術(shù)的還很少,特別在分批補(bǔ)料發(fā)酵策略的研究上基本沒(méi)有.基于此,本課題在前期搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇氮限制培養(yǎng)基(C/N=56/2.2)開(kāi)展了白腐真菌木質(zhì)素降解酶生物反應(yīng)器放大研究.采用反應(yīng)器分批發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵2種方式考察白腐真菌在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)和木質(zhì)素降解酶發(fā)酵的特征,為實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素降解酶發(fā)酵的有效放大提供科學(xué)依據(jù).1材料和方法1.1病毒采用的白腐真菌菌種是由本實(shí)驗(yàn)室保存的PhanerochaetechrysosporiumBKM-F-1767.1.2培養(yǎng)基1.2.1種子培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基,即馬鈴薯浸出液200g/L,葡萄糖20g/L,瓊脂20g/L.1.2.2氮限制及緩沖劑緩沖液配制參照Tien&KirkP.chrysosporium基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制,其中用0.02mol/L乙酸緩沖液(pH4.4)代替丁二酸二甲酯緩沖液.選擇氮限制(C/N=56/2.2)液體培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn),另外添加終濃度2mmol/L藜蘆醇.接種前無(wú)菌過(guò)濾加入VB1溶液,使其濃度為1mg/L.1.3白腐真菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶反應(yīng)器采用德國(guó)B.BraunBiotechInternational/SartoriusGroups生產(chǎn)的5L全自動(dòng)發(fā)酵罐(配置有pH和溶氧電極)作為白腐真菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶反應(yīng)器.1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1種子育種方法將斜面上的菌種接種到PDA種子培養(yǎng)基平板上于37℃下培養(yǎng)3~4d.1.4.2生物反應(yīng)器內(nèi)ph值的變化用接種針從培養(yǎng)3~4d的種子培養(yǎng)基上剝?nèi)∵m量孢子入無(wú)菌水中制成孢子懸濁液,然后接入含2L發(fā)酵液體培養(yǎng)基的5L生物反應(yīng)器中,使得反應(yīng)器內(nèi)接入的孢子量近似等于1×105個(gè)/mL.然后通過(guò)與反應(yīng)器相聯(lián)的控制器控制反應(yīng)器內(nèi)溫度恒定在37℃±0.5℃,攪拌速度為160r/min,每L液體培養(yǎng)基的通氣速率為0.5L/min.培養(yǎng)過(guò)程中每天定時(shí)取樣,測(cè)定MnP、Lac、葡萄糖、總氮和總磷,并且定時(shí)記錄培養(yǎng)過(guò)程中體系的pH值變化情況.1.5分析1.5.1光分光光度計(jì)可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV-1200V,SHIMADZU),可見(jiàn)紫外光分光光度計(jì)(UV-2401PC,SHIMADZU).藜蘆醇、2,2-連氮-二-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(簡(jiǎn)稱(chēng)ABTS)和次氮基三乙酸鹽均為Fluka公司產(chǎn)品,其余藥品均為分析純?cè)噭?1.5.2制備：粗酶溶液樣品經(jīng)離心(9000r/min,10min)得到上清液,用于酶活測(cè)定1.5.3pul3-連氮-二-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸氧基甲基錳過(guò)氧化物酶(MnP)采用Paszczynski方法,定義每1min氧化1μmolMn2+為Mn3+所需的酶量為1個(gè)酶活力單位.漆酶(Lac)采用Bourbonnais和Paice方法,定義每1min氧化1μmol2,2-連氮-二-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(簡(jiǎn)稱(chēng)ABTS)所需的酶量為1個(gè)酶活力單位.1.5.4葡萄糖法測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法進(jìn)行測(cè)定(葡萄糖試劑盒,中生北控生物科技股份有限公司).1.5.5采用氨基氮法測(cè)定納氏試劑的分光光度法1.5.6總氮測(cè)定硫酸鉀氧化-紫外分光光度法1.5.7總磷測(cè)定氯化亞錫還原光度法1.5.8測(cè)定細(xì)菌生物量實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將生物反應(yīng)器內(nèi)的菌絲小球取出、過(guò)濾,并在105℃下烘干至恒重.2結(jié)果與討論2.1生物反應(yīng)器發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果首先在5L生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行了白腐真菌間歇培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和圖2所示.從圖1可以看出,錳過(guò)氧化物酶在第4d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn),第6d達(dá)到峰值(155.06U/L),然后活性急劇下降,至第8d時(shí)已基本檢測(cè)不到錳過(guò)氧化物酶;而漆酶較錳過(guò)氧化物酶出現(xiàn)得早,但培養(yǎng)初期酶活很低,第6d時(shí)才達(dá)到11.3U/L,第7d達(dá)到峰值(68.00U/L).從錳過(guò)氧化物酶和漆酶出現(xiàn)的時(shí)間以及達(dá)到最大酶活的時(shí)間來(lái)看,生物反應(yīng)器發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與前期搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相一致的,僅是放大后酶活的絕對(duì)值降低,這一結(jié)果與Hess等人所得結(jié)果相同.造成酶活降低的原因可能與生物反應(yīng)器內(nèi)存在與搖瓶迥異的流體力學(xué)、混合和傳質(zhì)特點(diǎn)有關(guān).另外,由于實(shí)驗(yàn)初期采用漁泵向反應(yīng)器內(nèi)供氣造成供氣量不足,也影響白腐真菌次生代謝階段分泌木質(zhì)素降解酶.另外,從發(fā)酵過(guò)程中pH的變化來(lái)看(圖2),在發(fā)酵初期,也就是白腐真菌生長(zhǎng)期,發(fā)酵液pH是上升的,至第3d時(shí)達(dá)到峰值,隨后開(kāi)始下降.結(jié)合圖1和圖2,還可以看出,生物反應(yīng)器內(nèi)pH的變化與白腐真菌木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生是具有相關(guān)性的,當(dāng)白腐真菌進(jìn)入次生代謝階段開(kāi)始產(chǎn)酶時(shí),體系pH值開(kāi)始下降,隨著發(fā)酵后期酶活的降低,pH值下降的幅度也逐漸變小,當(dāng)體系酶活接近為0.0U/L時(shí),pH值基本不再變化.因此,可以得出,根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中體系pH值的變化間接了解反應(yīng)器內(nèi)木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生情況.2.2第1次補(bǔ)料為5由于在白腐真菌分批發(fā)酵試驗(yàn)中出現(xiàn)了錳過(guò)氧化物酶酶活比搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)低的問(wèn)題,一方面是由于發(fā)酵罐本身的水力條件和機(jī)械攪拌強(qiáng)度與搖瓶培養(yǎng)相差較大,另一方面可能是氣泵功率太小引起氧氣供給不足造成的(充氣速率小于0.1L/min;O2=20%~23%).因此,在反應(yīng)器分批補(bǔ)料試驗(yàn)中,采用空氣壓縮機(jī)來(lái)解決氧氣供給問(wèn)題(保證充氣速率穩(wěn)定在0.5L/min;O2=80%~85%).依據(jù)前期白腐真菌分批發(fā)酵試驗(yàn)得到的結(jié)果,計(jì)劃在錳過(guò)氧化物酶酶活出現(xiàn)峰值的第6d開(kāi)始補(bǔ)料,補(bǔ)料液選擇與初始液體培養(yǎng)基組成完全相同的營(yíng)養(yǎng)液.但是,更換氣源以后,由于溶氧濃度有很大提高(O2=80%~85%),使得木質(zhì)素降解酶出現(xiàn)的時(shí)間有明顯的提前,第4d就出現(xiàn)錳過(guò)氧化物酶和漆酶的酶活峰值(MnP=206.8U/L;Lac=30U/L),并且錳過(guò)氧化物酶酶活有了顯著升高(是采用漁泵發(fā)酵培養(yǎng)的1.33倍),如圖3所示.因此,第5d發(fā)現(xiàn)錳過(guò)氧化物酶酶活降低以后,于當(dāng)天馬上進(jìn)行補(bǔ)料,補(bǔ)料體積為200mL,同時(shí),從反應(yīng)器內(nèi)排出200mL粗酶液.培養(yǎng)第7d下午發(fā)現(xiàn)錳過(guò)氧化物酶酶活接近0U/L時(shí),開(kāi)始進(jìn)行第2次補(bǔ)料,補(bǔ)料體積為500mL培養(yǎng)基.由于此時(shí)沒(méi)有酶活收獲,這批試驗(yàn)沒(méi)有從反應(yīng)器提取酶液.從圖3可以看出,補(bǔ)料以后,酶活隨有上升,但幅度很小.第1次補(bǔ)料后,錳過(guò)氧化物酶酶活2d僅升高18.5U/L;而第2次補(bǔ)料后,酶活增加得更少,2d錳過(guò)氧化物酶僅增加7.4U/L.從圖3還可以看出,補(bǔ)料對(duì)漆酶影響不大,2次補(bǔ)料后漆酶均未增加,始終在0U/L附近波動(dòng).因此,從補(bǔ)料策略上,進(jìn)行培養(yǎng)基補(bǔ)料不能很好地刺激白腐真菌分泌次生代謝產(chǎn)物.結(jié)合前期搖瓶試驗(yàn)結(jié)果,探索采用碳源補(bǔ)料策略是今后的研究方向.圖4顯示了2次補(bǔ)料前后反應(yīng)體系內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物的變化情況.從圖4中可以看出,補(bǔ)料前反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖和總磷濃度還剩余較多,分別為41.3mmol/L和312.6mg/L,比初始濃度僅減少29.5%和12.6%;而總氮消耗較快,培養(yǎng)第2d在反應(yīng)器內(nèi)就檢測(cè)不出總氮濃度,總氮的變化與木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生是相對(duì)應(yīng)的(圖3).因?yàn)樵囼?yàn)中選擇的液體培養(yǎng)基是氮限制培養(yǎng)基(C/N=56/2.2),所以當(dāng)體系內(nèi)氨氮耗盡時(shí),白腐真菌進(jìn)入次生代謝階段,開(kāi)始產(chǎn)酶.但這種次生代謝產(chǎn)酶現(xiàn)象在第2次補(bǔ)料時(shí)并不明顯.圖4b顯示第10d時(shí)體系內(nèi)總氮已耗盡,但第10d和第11d所檢測(cè)出的錳過(guò)氧化物酶很少,其酶活僅為7.3U/L.另外,從補(bǔ)料后營(yíng)養(yǎng)物的消耗速率上也可以看出,第2次補(bǔ)料后葡萄糖、總氮和總磷的消耗速率明顯低于第1次補(bǔ)料,這也間接反映體系內(nèi)白腐真菌的生理活性下降.由此說(shuō)明,白腐真菌次生代謝產(chǎn)酶機(jī)理是復(fù)雜的,并不完全是在某一限制底物耗盡時(shí)產(chǎn)酶,而與白腐真菌菌體生物活性和體系內(nèi)的代謝產(chǎn)物的量有關(guān).因此,在白腐真菌分批補(bǔ)料發(fā)酵策略方面還有許多問(wèn)題有待于進(jìn)一步深入探究.白腐真菌分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中體系pH變化如圖5所示.從圖5中可以看出,白腐真菌在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中pH變化還是有一定規(guī)律的,與前期白腐真菌分批發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)相似,在白腐真菌生長(zhǎng)階段體系pH會(huì)逐漸升高,到次生代謝產(chǎn)酶階段時(shí)體系pH開(kāi)始下降.并且當(dāng)體系酶活降低時(shí),pH下降的幅度也逐漸減小,至酶活接近0U/L時(shí)體系pH變化也趨于穩(wěn)定.2次補(bǔ)料后體系pH變化不完全一致的原因是由于2次補(bǔ)料體積不同造成的,第1次補(bǔ)料僅向反應(yīng)體系投加200mL液體培養(yǎng)基,占總體積的10%,如此低濃度的底物很快被白腐真菌所利用,這一變化從營(yíng)養(yǎng)物的消耗速率上也可以得出.另外,從第1次補(bǔ)料后體系的錳過(guò)氧化物酶酶活變化也可以看出,補(bǔ)料后酶活仍然增加.因此,第1次補(bǔ)料后體系pH并沒(méi)有上升而是繼續(xù)下降.而由于第2次補(bǔ)料體積是500mL,是第1次補(bǔ)料的2.5倍,而且補(bǔ)料時(shí)錳過(guò)氧化物酶酶活已接近0U/L,因此,體系內(nèi)白腐真菌首先利用補(bǔ)加的營(yíng)養(yǎng)物生長(zhǎng),這就使得第2次補(bǔ)料后體系pH有緩慢上升的趨勢(shì).綜上,在白腐真菌的發(fā)酵階段,體系pH值變化與其生長(zhǎng)和產(chǎn)酶具有一定的相關(guān)性.因此,可以依據(jù)發(fā)酵過(guò)程中體系pH的變化間接了解白腐真菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶情況.3發(fā)酵過(guò)程中體系ph值的變化對(duì)白腐真菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響(1)初步實(shí)現(xiàn)了白腐真菌在生物反應(yīng)器內(nèi)的放大培養(yǎng),其酶活隨時(shí)間的變化規(guī)律與搖瓶試驗(yàn)基本相同,只是由于反應(yīng)器本身的水力條件和機(jī)械攪拌強(qiáng)度與搖瓶試驗(yàn)相差較大,使得酶