普洱茶中兒茶素組分的測(cè)定

普洱茶中兒茶素組分的測(cè)定

茶葉中所含的多酚類物質(zhì)是茶中的多元酚類混合物。其中最重要的是以兒茶素為主體的黃烷醇類,其含量約占多酚類總量的70%～80%,是茶樹(shù)次生物質(zhì)代謝的重要成分,也是茶葉保健功能的首要成分,對(duì)茶葉的色、香、味品質(zhì)的形成有重要作用。酚酸是一類分子中具有羧基和羥基的芳香族化合物。早在19世紀(jì)中葉就開(kāi)始了茶葉中酚酸的研究。1847年從綠茶中分出沒(méi)食子酸,沒(méi)食子酸在茶葉中的含量約為干物質(zhì)的0.5%～1.4%。沒(méi)食子酸具有強(qiáng)抗氧化性,并且具有抗腫瘤、抗血栓等藥理作用,在食品工業(yè)及醫(yī)藥工業(yè)中有廣泛用途和應(yīng)用前景。對(duì)于茶成分的研究,傳統(tǒng)的茶分離分析方法還比較有限,茶中被較多分析的是兒茶素類,它們屬于多酚類化合物,是茶葉藥效的主要活性組分,具有防止血管硬化、防止動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、消炎抑菌、防輻射、抗癌、抗突變等多種功效。目前,關(guān)于茶葉兒茶素的測(cè)定方法的報(bào)道已經(jīng)很多,主要有薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、液相色譜-紫外檢測(cè)(LC-UV)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)和膠束毛細(xì)管電動(dòng)色譜(MEKC)等常用測(cè)定方法。本文主要采取高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定普洱茶中右旋兒茶素(+C)、表兒茶素(EC)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、沒(méi)食子兒茶素(GC)、兒茶素沒(méi)食子酸酯(CG)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)和沒(méi)食子酸(GA)9種兒茶素組分的含量,此法快速簡(jiǎn)便,能夠同時(shí)測(cè)定多種兒茶素,效果較好。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1poli-rp/roli-rp/phenosenex生長(zhǎng)高效液相色譜儀:日本島津公司;分析色譜柱:Phenomenex公司Phenomenexpolar-RP80150×2.0mm4micron。1.1.2帶模帶空蒸餾器十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司);電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);自動(dòng)雙重純水蒸餾器(德國(guó)Sartorius公司);三角瓶,醫(yī)用注射器,0.2μm水系微孔濾膜。1.1.3新生兒指標(biāo)表1兒茶素類化合物標(biāo)樣:(+)兒茶素(+C)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社)、表兒茶素(EC)(美國(guó)ACROSORGANICS公司)、沒(méi)食子兒茶素(GC)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、兒茶素沒(méi)食子酸酯(CG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)、沒(méi)食子酸(GA)(美國(guó)SIGMA公司)。高純水:18.2MΩ/cm;甲醇:色譜純,德國(guó)MERCK公司;冰醋酸:分析純。1.2測(cè)試方法1.2.1流動(dòng)相梯度變化色譜條件為:流動(dòng)相A為0.1%的乙酸溶液,流動(dòng)相B為甲醇,流動(dòng)相洗脫梯度:流動(dòng)相A:0.1%乙酸水溶液,流動(dòng)相B:甲醇;流速:0.5mL/min;流動(dòng)相梯度:從0到15min,流動(dòng)相B即有機(jī)相甲醇,從10%到60%;從15到20min,流動(dòng)相B保持在60%;從20到20.5min,流動(dòng)相B從60%回到10%;從20.5到25min,整個(gè)分析周期結(jié)束,流動(dòng)相B保持在10%。柱溫30℃;紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)278nm,檢測(cè)器掃描范圍200～350nm;分析周期25min,進(jìn)樣量10μl(表1)。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別稱取9種兒茶素類化合物的固體標(biāo)樣各10mg,用50%的甲醇水溶液溶解并定容至10mL。則以上9種兒茶素類化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度均為1mg/mL?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液:各取9種兒茶素類化合物的單標(biāo)儲(chǔ)備液1mL,混合并用50%的甲醇水溶液定容至10mL,則混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為100μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線混合溶液:先取100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5mL,用50%的甲醇水溶液定容至10mL,得到50μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;再取100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,用50%的甲醇水溶液定容至10mL,得到10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;再分別取0.5和2.5mL的50μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用50%的甲醇水溶液定容至25mL,分別得到1和5μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。最終得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線混合溶液的濃度分別為1、5、10、50、100μg/mL。1.2.3加標(biāo)樣品的制備將普洱茶樣品先進(jìn)行粉碎,過(guò)40目的篩子,再準(zhǔn)確稱量1.0g普洱茶樣品放入三角瓶中,加入120mL的純水,在70℃的水浴中浸提50min,然后將上清液過(guò)0.2μm水系微孔濾膜,裝入進(jìn)樣瓶中,即可用于分析。2結(jié)果與分析2.1分離度的保證采用色譜條件對(duì)兒茶素類化合物各組分的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品以及普洱茶樣品進(jìn)行分析,所得的色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。從標(biāo)樣圖中可以看出,兒茶素類化合物各組分之間的分離度良好,分離效果令人滿意。同時(shí)各組分的峰型也呈現(xiàn)出良好的對(duì)稱性,分析周期為25min,在保證了分離效果的同時(shí),實(shí)現(xiàn)了快速分析的目的和效果。根據(jù)圖1、2所得的兒茶素類化合物各組分標(biāo)樣和普洱茶樣品的保留時(shí)間見(jiàn)表2,從表中可以看出,普洱茶樣品中絕大部分兒茶素類化合物各組分的保留時(shí)間同標(biāo)樣的保留時(shí)間重現(xiàn)性良好,說(shuō)明方法的穩(wěn)定性,可信性很高。2.2色譜峰面積的檢測(cè)本方法采用了外標(biāo)法對(duì)兒茶素類化合物各組分進(jìn)行定量分析。根據(jù)各個(gè)組分的保留時(shí)間對(duì)各組分進(jìn)行定性,根據(jù)各組分的色譜峰峰面積進(jìn)行定量。所得各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3,其中在標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中的Y為為標(biāo)樣濃度,X標(biāo)樣各組分色譜峰面積。從圖和表中可以看出,各條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都在0.9990～0.9998之間,說(shuō)明各組分的峰面積與各組分之間具有良好的相關(guān)性。使用外標(biāo)法對(duì)兒茶素類化合物各組分進(jìn)行定量,有良好的線性,可以滿足定量的要求。3分析方法及檢測(cè)周期(1)本方法能夠同時(shí)對(duì)9種兒茶素類化合物組分進(jìn)行分析檢測(cè),并使得各組分之間的分離度良好,同時(shí)整個(gè)分析周期只有25min,因此是一種快速、高效、準(zhǔn)確的分析方法。(2)本方法操作簡(jiǎn)單,所使用的試劑、儀器均為較常使用的,這就大大降低了前處理過(guò)程的勞動(dòng)強(qiáng)度,降低了實(shí)驗(yàn)成本。(3)本方法采用外標(biāo)法對(duì)兒茶素類化合物各組分進(jìn)行定量,所得到的各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程線性良好,說(shuō)明本方法的準(zhǔn)確性令人滿意。(4)同其他的兒茶素類化合物分析檢測(cè)方法相比,本方法可以一次性檢測(cè)出更多的兒茶素類,包括8種兒茶素以及沒(méi)食子酸,共9種物質(zhì)?？岛幍冉⒌姆椒ㄖ粰z測(cè)了包括沒(méi)食子兒茶素(GC),表沒(méi)食子兒茶素(EGC),表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG),表兒茶素(EC),表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)在內(nèi)的5種兒茶素。高俊等建立的方法檢測(cè)了包括兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、沒(méi)食兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)在內(nèi)的6種兒茶素。鐘世安等建立的方法檢測(cè)了包括表兒茶素(EC),表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG),表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG),表沒(méi)食子兒茶素(EGC),沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG),兒茶素(C)在內(nèi)的6種兒茶素類化合物。因此,本方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)兒茶素類化合物以及在兒茶素形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用的沒(méi)食子酸的全檢測(cè),