普洱茶水提物的分離篩選及化學成分分析

普洱茶水提物的分離篩選及化學成分分析

20世紀80年代末的分離和評價聯(lián)合技術(shù)為研究活動因素提供了有利的條件。高效液相色譜(HPLC)法在茶葉多酚測定中被廣泛利用[1~3],尤其通過紫外光電二極管陣列檢測器,能對各個分離峰的鑒定提供許多有用的信息。但對天然產(chǎn)物中活性成分的化學結(jié)構(gòu)進行更準確的鑒定,還需借助更精密的儀器,如核磁共振儀(NMR)、近紅外光譜(NIR)和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)等。其中液質(zhì)聯(lián)用法以適當接口(例如電噴霧離子化(ESI)、大氣壓離子化(APCI)接口)傳輸至質(zhì)譜儀,對粗提物成分提供分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息。后發(fā)酵茶屬我國特有的茶類,由于其獨特的風味和保健功能,熱銷于國內(nèi)外市場。以普洱茶為代表的后發(fā)酵茶與紅、綠茶的主要區(qū)別在于前者經(jīng)過特殊的加工工藝,在渥堆即“后發(fā)酵”的過程中形成了一些特異的多酚類物質(zhì)(可能是兒茶素寡聚體為主的多酚類非酶性氧化產(chǎn)物)。中國科學院昆明植物所的研究人員從普洱茶中分離出一種高氧化的黑茶素類化合物(puerins),為普洱茶中存在特異多酚類物質(zhì)提供了有力證據(jù)。鑒于普洱茶的特殊保健功能可能與其含有的特異多酚類物質(zhì)(如兒茶素的寡聚體等)密切相關(guān),因此有必要從化學組成和結(jié)構(gòu)等方面對其進行研究。本文對普洱茶以及各萃取組分進行了體外清除自由基的能力測定;采用LC-MS法鑒定萃取組分中的活性成分,旨在了解我國后發(fā)酵茶獨特的保健作用機理。1材料和方法1.1加樣、本樣的制備普洱茶粉,自制。取普洱茶(由浙江省茶葉進口公司提供,產(chǎn)地云南)以1∶10、1∶5的茶水比例在沸蒸餾水中浸提2次(30min),合并浸提液,真空冷凍干燥,得普洱茶粉(PTW)。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG,純度>98%)與茶多酚(TP,純度TP>95%,EGCG>40%)由浙江大學茶葉科技開發(fā)有限公司提供;二苯基苦基偕腙肼(DPPH)、兒茶素標樣與茶黃素標樣均購自Sigma公司;甲醇、乙腈(色譜純)購自天津四友有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)A.R級。1.2高效液相色譜分析LCMS-2010高效液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(日本Shimadzu公司)配有LC-10AD泵、SPD-M10A二極管陣列檢測器、DGU-14AM脫氣裝置、SIL-HTA自動進樣器、CTO-10AS柱溫箱、LCMS-2010A質(zhì)譜、干燥氣體控制器、SLP-221CD壓縮機(AnestIwataCorporation,日本)與LCMSsolutionversion2.04色譜分析軟件。1.3萃取組分的提取取40g普洱茶粉,用蒸餾水(質(zhì)量比1∶10)配成溶液,倒入分液漏斗中,分別用等體積的氯仿、乙酸乙酯,正丁醇各萃取3次,每次萃取2h。氯仿萃取后所得氯仿層為PCF,乙酸乙酯萃取后所得乙酸乙酯層為PEAF,正丁醇層為PBF。正丁醇萃取后所得水層加乙醇至最終體積分數(shù)為75%,得到沉淀物PD與剩余相PR。將各萃取層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑后轉(zhuǎn)溶于水中,冷凍干燥得各萃取組分。萃取流程見圖1。1.4方法1.4.1火炬對加樣樣品od測定的不同方法將溶于甲醇的DPPH(濃度1mmol/L)0.8mL,與2.4mL不同濃度的普洱茶各萃取組分的甲醇溶液混合,充分混勻后于暗室(室溫)中放置30min,在517nm下測定吸光值OD樣品。以甲醇代替各樣品溶液作為對照測得吸光值ODck,DPPH清除率計算公式為:DPPH清除率(%)=(ODck-OD樣品)×100/ODck。1.4.2流動相a5eHPLC-MS儀器中HPLC部分:UG120C-18柱:2.0mm×150mm,5μm(日本Shiseido公司);檢測器波長200~600nm,柱溫35℃,流速0.2mL/min,進樣量10μL;流動相A為乙酸、乙腈和重蒸水(體積比0.5∶3∶96.5);流動相B為乙酸、乙腈和重蒸水(體積比0.5∶30∶69.5);洗脫梯度:0~45minB流動相由0%~100%,45~60minB流動相為100%。HPLC-MS儀器中MS部分:離子源:ESI(電噴霧),含正、負離子,質(zhì)量范圍100~900m/z。干燥氣體流速1.5L/min,毛細管電壓1.5kV,干燥溫度250℃。1.4.3統(tǒng)計方法2結(jié)果2.1加標回收法dpph各萃取組分對dpph自由基的清除效果由表1可知,在DPPH反應(yīng)體系中,各萃取組分濃度的對數(shù)與清除率存在線性關(guān)系(P<0.05)。由線性方程得出的抑制50%DPPH時所需濃度(IC50),可以了解普洱茶水提物及其各萃取組分對DPPH自由基的清除效果,其由強到弱依次為PEAF>PBF>PTW>PD>PR。PEAF具有最強的抗氧化性,對該組分進行活性成分的鑒定。2.2黃酮苷類物質(zhì)的鑒定圖2是PEAF的HPLC分析圖譜,共有27種成分被分離。表2列出了HPLC圖中各個峰的最大吸收波長、MS鑒定結(jié)果及被推測的物質(zhì)。除沒食子酸(峰號1)、兒茶素類物質(zhì)(峰號3、5、6、8、9、13)的鑒定主要基于標樣與MS鑒定的分子質(zhì)量外,其余物質(zhì)的鑒定主要是通過相關(guān)物質(zhì)的參考文獻及MS鑒定推斷的。黃酮苷類物質(zhì)在酸性條件下易失去糖苷基。大多數(shù)的黃酮醇糖苷配基都能在總離子流色譜圖中被檢測到。一些常見的黃酮醇糖苷配基的正離子峰碎片有山奈酚(m/z287)、槲皮素(m/z303)及楊梅素(m/z319)等,通過這些離子峰碎片可推測出PEAF中一些黃酮苷類物質(zhì)(峰號16、18、25、26、27)。峰號11、12、14、19、21、22、24經(jīng)鑒定為普洱茶中一些特殊的兒茶素寡聚體,其中峰號11與14分別為黑茶素類化合物———普洱茶素(puerin)B和A,峰號12與22為金雞納素Ib(α、β型)。峰號10與20經(jīng)MS中離子峰碎片鑒定,推測其為表沒食子兒茶素-[8,7-e]-4α(β)-(3,4-二羥基苯)-3,4-二氫-2(3H)-吡喃酮的α、β型(相關(guān)離子峰碎片m/z分析見圖3)。對此物質(zhì)的鑒定,目前尚未見相關(guān)報道。表3列出了PEAF中被推測物質(zhì)的歸屬及化學結(jié)構(gòu)。PEAF中多酚類物質(zhì)大致被分為酚酸類、兒茶素類、兒茶素衍生物、黃酮醇及其糖苷類物質(zhì)。3酚類物質(zhì)及抗氧化活性的變化液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)能夠?qū)⑸V的分離性能與質(zhì)譜的強定性優(yōu)勢相結(jié)合。在分析過程中,首先利用二極管陣列檢測器(DAD)初步判斷化合物的結(jié)構(gòu)類型,然后由一級質(zhì)譜給出化合物的準分子離子峰,再結(jié)合多級質(zhì)譜功能,對供試液中未知化合物進行結(jié)構(gòu)預(yù)測,推斷化合物結(jié)構(gòu),從而簡化了分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定的過程。二苯基苦基偕腙肼是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,若被測樣品能將其清除,則表明其具有降低羥自由基、烷自由基或過氧化自由基的有效濃度及抑制脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。目前DPPH測定常用于評估食品或植物提取物的抗氧化活性[12~14]。DPPH有個孤對電子,在517nm處有強吸收,其甲醇溶液呈深紫色。本試驗驗證了DPPH濃度與其吸光值具有很好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0.0083x(R2=0.988,p<0.01,線性范圍0~420μmol/L,x為DPPH濃度,y為吸光值)。普洱茶各萃取組分與DPPH在30min內(nèi)完全反應(yīng)并達到穩(wěn)定狀態(tài)。普洱茶的乙酸乙酯層在各萃取組分中顯示出最強的DPPH清除能力(見表1),這可能與其含有的多酚類物質(zhì)有關(guān),因此有必要對其多酚類組分進行鑒定。通過部分標樣對照、參考相關(guān)文獻及LC-MS測定,在普洱茶乙酸乙酯層中鑒定出的活性成分大致分為酚酸類、兒茶素類、兒茶素衍生物、黃酮醇及其糖苷類物質(zhì)。酚酸是一類分子中含有羧基和羥基的芳香族化合物?？s酚酸是由酚酸上的羧基與另一酚酸分子上的羥基相互作用(縮合)而成。從茶葉中已鑒定的酚酸物質(zhì)為沒食子酸、咖啡酸、綠原酸、對香豆酸、鞣花酸、茶沒食子酸及雞納酸的縮合衍生物等。本試驗中鑒定出的酚酸類物質(zhì)主要為4-羥基苯甲酸、二羥基苯甲酸、沒食子酸。這些化合物分別在云南普洱茶原料曬青毛茶、云南省雙江縣勐庫產(chǎn)的普洱茶、沱茶中被檢測到。其中沒食子酸為重要的酚酸類物質(zhì),且普洱茶中沒食子酸的含量高于綠茶,這已在作者前期的試驗中得到證實。大量的研究已證實兒茶素物質(zhì)具有較強的清除自由基和抗氧化活性。在曬青毛茶中分離到的兒茶素類物質(zhì)主要為表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、EGCG、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、兒茶素(C)、沒食子兒茶素(GC)與表阿福豆素-3-O-沒食子酸酯。從云南省雙江縣勐庫產(chǎn)的普洱茶中分離的兒茶素類物質(zhì)主要為GC、EC、C。從沱茶中分離的兒茶素類物質(zhì)為EC、C、EGC、EGCG。從云南“生態(tài)茶”中分離的兒茶素類物質(zhì)為C、EC、GC、EGC、ECG、EGCG。在本試驗中也鑒定出上述的兒茶素類物質(zhì)。此外還鑒定出4種特征性的金雞納素型氧化黃烷醇類內(nèi)酯化合物(如普洱茶素A與B等)。這些物質(zhì)早已從云縣普洱茶、沱茶中分離得到,且在曬青毛茶中未檢測到黑茶素化合物,推測可能是在渥堆發(fā)酵過程中單寧氧化酶和微生物作用的結(jié)果。通過LC-MS測定推測普洱茶中可能含有第5種特征性的金雞納素型氧化黃烷醇類內(nèi)酯化合物,即表沒食子兒茶素-[8,7-e]-4α(β)-(3,4-二羥基苯)-3,4-二氫-2(3H)-吡喃酮,還有待試驗證實。原花青素是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成。最簡單的原花青素是兒茶素或表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體,此外還有三聚體、四聚體等直至十聚體。自從發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物——原花青素具有卓越的抗氧化作用后,對兒茶素寡聚體的研究引起了關(guān)注。UchidaS.等發(fā)現(xiàn)兒茶素的抗氧化活性隨著聚合度而遞增,對自由基的清除能力:單體<二聚體<三聚體<四聚體,五聚體、六聚體具有強的抗氧化性。在紅茶及普洱茶中已鑒定出原花青素類物質(zhì)(原花色素、原花青色素及原飛燕色素等)的二聚物、三聚物及單、雙沒食子酸酯。本試驗中,在普洱茶的乙酸乙酯層僅檢測到原花青素的二聚體(表2中峰號7),推測更大分子質(zhì)量的聚合物可能存在于普洱茶的其它萃取組分中。目前從綠茶及紅茶中分別鑒定出20種黃酮醇及其糖苷類物質(zhì)。這些化合物包括山奈素、槲皮素、異槲皮素、楊梅素及其單、雙、三糖苷(半乳糖苷、鼠李糖苷及葡糖苷等)類物質(zhì)[19~21]。黃酮苷被認為是綠茶湯色的重要組分。黃酮醇苷水解時得到的糖有葡萄糖、鼠李糖、半乳糖和蕓香糖等。苷類化合物的水溶液有苦味,水解成苷元和糖體后苦味消失。黃酮類物質(zhì)色黃,氧化產(chǎn)物為橙黃色以至棕紅色,此類物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物對紅茶茶湯的色澤與滋味都有一定的影響。另有研究證實綠茶中一些黃酮醇糖苷類物質(zhì)在護肝功效中發(fā)揮了一定的作用[22~23]。本試驗中,在普洱茶中鑒定出的黃酮醇及其糖苷類物質(zhì),包括山奈素、槲皮素及其單、雙、三糖苷類物質(zhì)(見表2、表3)。與云南省雙江縣勐庫產(chǎn)的普洱茶相比,未檢測到楊梅素及其糖苷類物質(zhì)。以上的試驗結(jié)果提示不同來源的普洱茶的化學成分有明顯的差異,這可能是由于原料產(chǎn)地、制作工藝等不同引起的。比較從普洱茶中分離到的化合物的抗氧化活性可知,兒茶素類物質(zhì)與簡單酚類化合物(沒食子酸等)具有較高活性,黃酮類化合物次之,黃酮苷類物質(zhì)活性較差。因此表明了兒茶素與沒食子酸在普洱茶的抗氧化活性中起著重要的作用。同時發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上有鄰位羥基的化合物,其清除自由基的活性較強,且羥基越多活性越強。上述研究對各個化合物之間的自由基清除能力(IC50)作了比較,揭示了普洱茶中哪些化合物具有抗氧化活性。至于誰對普洱茶的抗氧化功效貢獻最大,還有待于進一步的研究。普洱茶的一些特殊保健功能可能與存在的特異多酚類物質(zhì)如兒茶素的寡聚體等相關(guān)。本課題組曾報道在普洱茶乙酸乙酯萃取層中分離出的E8層,在清除羥自由基、超氧陰離子能力及其對H2O2誘導(dǎo)HPF-1細胞損傷的保護作用方面均強于EGCG,同時在E8層中