不同產(chǎn)地姜、炮姜中有效成分的比較研究

不同產(chǎn)地姜、炮姜中有效成分的比較研究

干姜是姜科植物的一種干燥的根，具有辛味甘熱，可歸經(jīng)脾、胃、腎、心、肺經(jīng)絡(luò)。具有溫中散寒,回陽通脈,溫肺化飲之功。用于腕腹冷痛,嘔吐泄瀉,肢冷脈微,寒飲喘咳等癥。炮姜是干姜經(jīng)砂燙法制得的炮制加工品,味辛,性熱,歸脾、胃、腎經(jīng)。具有溫經(jīng)止血,溫中止痛之功。用于陽虛失血,吐衄崩漏,脾胃虛寒,腹痛吐瀉等癥。干姜、炮姜均為生姜的加工炮制品,而兩者主治功效差異甚大,這必與其炮制前后的成分改變有很大關(guān)系。查閱文獻,目前對干姜、炮姜中總的成分的比較研究鮮見報道。多糖類物質(zhì)在中藥中廣泛存在,具有降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性。有研究表明,生姜中所含的多糖類物質(zhì)有很好的抗氧化活性。姜酚類物質(zhì)是目前生姜中發(fā)現(xiàn)的另一大類有效物質(zhì)。藥理學(xué)方面的實驗研究證實,姜酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、抗神經(jīng)損傷和細胞保護、抗嘔吐等多種生理活性。近年來的研究還表明,生姜中富含黃酮類成分,且該類成分具有抗氧化、抑菌等生理活性。干姜、炮姜為生姜的炮制加工品,生姜經(jīng)過一定的炮制,其中的多糖、總酚、黃酮類物質(zhì)是否發(fā)生了改變,目前尚未見到相關(guān)文獻的報道。對干姜、炮姜中幾種姜酚類成分的測定雖有相關(guān)報道,但是所取樣本地域范圍較小,不足以體現(xiàn)我國幅員遼闊,及生姜出口大國的地位。本實驗對來自全國多個產(chǎn)地的干姜、炮姜中所含的多糖類、總酚類、總黃酮類成分及幾種姜酚類物質(zhì)進行了定量測定及比較研究,以期為進一步研究生姜的炮制機理進行一定的探索。1儀器和試劑盒1.1高效液相色譜儀;島津UV-2401紫外可見分光光度計;SartoriusBP211D型電子天平;TCG-16G臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。Waterse2695型高效液相色譜儀,2998PDA檢測器,Millennium32色譜管理系統(tǒng);SartoriusBP211D型電子天平。1.2試劑與檢測方法葡萄糖(批號110833200503)、沒食子酸(批號110831-200803);蘆丁(批號080-9303)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所(供含量測定用);6-gingerol(批號111228)、8-gingerol(批號120302)、10-gingerol(批號120316)、6-shogaol(批號110516)對照品均購自四川維克奇生物科技有限公司,經(jīng)HPLC檢測為單一成分,純度達到98%以上。乙腈、甲醇為色譜純;水為亞沸蒸餾水(自制);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。生姜藥材產(chǎn)地分別為海南海口、湖北武漢、山東滕州、山東郯城、福建永春、湖南永州、江西上饒、安徽澮溝、四川西昌、江蘇鄒莊。以上生姜均為2012年3月收集得到。1.3干姜的制備1.4干法飲片制備將上述各產(chǎn)地的生姜(與制備干姜的生姜為同一批次),洗凈,切片,50℃干燥,得干姜飲片;將此干姜飲片按砂燙法燙至鼓起,表面棕褐色時,取出,放涼;打粉,過4號篩,即得。2方法和結(jié)果2.1多酚測定2.2總酚測定2.3黃酮法2.3.1試劑的制備2.3.1.1.對照溶液的制備精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品適量,加60%乙醇,配制成0.2090mg/mL的對照品貯備液。2.3.1.上清液液制備精密稱取干姜細粉1.0g,加60%乙醇20mL,超聲(工作頻率80kHz,功率250W)30min,離心(4900r/min)5min,取上清液置50mL量瓶中,殘渣加60%乙醇洗滌2次,每次5mL,同前離心,合并上清液,加60%乙醇定容,搖勻。2.3.1.3.生姜樣品溶液的制備精密稱取炮姜細粉1.0g,同“干姜供試品溶液的制備”項下操作。即得。2.3.2最大吸收波長的確定精密吸取對照品溶液、干姜供試品溶液、炮姜供試品溶液各0.5、0.5、0.2mL,分別置于10mL的棕色具塞試管中,分別加入60%乙醇0.5、0.5、0.8mL,搖勻,分別依次加入甲醇1mL,10%AlCl3溶液0.1mL和0.1mL醋酸鉀溶液,蒸餾水2.8mL,60%乙醇5.0mL,搖勻,室溫放置30min,于200~400nm范圍內(nèi)進行光譜掃描,結(jié)果表明,對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為270nm(見圖1)。2.3.3alcl3-過濾法精密吸取對照品貯備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL具塞試管中,分別加60%乙醇1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0mL,加入1.0mL甲醇,10%AlCl3溶液0.1mL和0.1mL醋酸鉀溶液,蒸餾水2.8mL,60%乙醇5.0mL,搖勻,室溫放置30min,在270nm測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程為Y=0.0398X-0.0203,r=0.9999。線性范圍為4.18~20.90μg/mL。2.3.4精密度測試取0.01254mg/mL的對照品溶液,重復(fù)測定6次,記錄其吸光度的值,RSD為0.45%,結(jié)果表明儀器精密度良好。2.3.5穩(wěn)定性試驗2.3.5.穩(wěn)定性測定精密吸取新鮮配制的干姜供試品(江蘇鄒莊產(chǎn))溶液0.5mL置于10mL的棕色具塞試管中,照“2.3.2”項下操作,分別于0、0.5、1、1.5、2h測定其在270nm處的吸光度,結(jié)果RSD為0.76%,結(jié)果表明本法所測樣品在2h內(nèi)保持穩(wěn)定。2.3.5.乙醇吸收劑用量測定精密吸取新鮮配制的炮姜供試品(江蘇鄒莊產(chǎn))溶液0.2mL,加60%乙醇0.8mL,置于10mL的棕色具塞試管中,照“2.3.2”項下操作,分別于0、0.5、1、1.5、2h測定其在270nm處的吸光度,結(jié)果RSD為0.88%。表明本法所測的干姜、炮姜樣品溶液在2h內(nèi)保持穩(wěn)定。2.3.6黃酮含量測定分別精密稱取產(chǎn)自江蘇鄒莊并經(jīng)低溫干燥至恒重的干姜、炮姜細粉約1.0g,平行6份。分別制成供試品溶液,照“2.3.2”項下操作,結(jié)果其中干姜所含黃酮的平均含有量為1.09%,RSD為0.99%;炮姜所含黃酮的平均含有量為2.71%,RSD為1.20%。表明所測樣品的重復(fù)性良好。2.3.7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)回收率試驗2.3.7.加樣回收及加樣回收率試驗取蘆丁對照品適量,加60%乙醇溶解,配成質(zhì)量濃度為0.5642mg/mL的溶液,作為加樣對照品貯備液。取產(chǎn)自江蘇鄒莊并經(jīng)低溫干燥至恒重的干姜細粉,精密稱取該細粉約0.5g,平行6份,精密加入加樣對照品貯備液10.0mL,加60%乙醇10mL,照“2.3.1.2”及“2.3.2”項下操作,于270nm處測定吸光度的值并計算回收率,得平均回收率為100.02%,RSD為1.57%。2.3.7.品貯備液制備取蘆丁對照品適量,加60%乙醇溶解,配成質(zhì)量濃度為1.3645mg/mL的溶液,作為加樣對照品貯備液。取產(chǎn)自江蘇鄒莊并經(jīng)低溫干燥至恒重的炮姜細粉,精密稱取該細粉約0.5g,平行6份,精密加入加樣對照品貯備液10.0mL,加60%乙醇10mL,照“2.3.1.2”及“2.3.2”項下操作,于270nm處測定吸光度的值并計算回收率,得平均回收率為99.46%,RSD為1.02%。2.3.8黃酮含量的測定取各產(chǎn)地的干姜、炮姜細粉,各精密稱取約1.0g,每個產(chǎn)地平行3份,按供試品溶液制備方法制備,照“2.3.2”項下操作,測定其270nm處的吸光度,每份平行測定2次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其中黃酮的量。結(jié)果見表3。2.4一些活性物質(zhì)的測定2.4.1柱溫2.2檢測方法AgilentTC-C18(2)(4.6mm×250mm,5μm);流動相為乙腈(A)-水(B),梯度洗脫(0~15min,15%~50%A;15~45min,50%A;45~65min,50%~80%A;65~67min,80%~100%A;67~69min,100%~15%A;再保持13min至82min);體積流量1.0mL/min;柱溫30℃;檢測波長280nm。理論塔板數(shù)以6-gingero計不低于4000,并且6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol、6-shogaol與其他相鄰組分的分離度均大于1.5。見圖2。2.4.2溶液的制備2.4.2.-shagoal混合對照品貯備液的制備取減壓干燥至恒重的6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol、6-shogaol適量,精密稱定,配制含6-gingerol3002μg/mL、8-gingerol376μg/mL、6-shogaol74μg/mL、10-gingerol452μg/mL的混合對照品溶液,作為混合對照品貯備液。2.4.2.離心線率限制精密稱取各產(chǎn)地干姜、炮姜各1.0g,加30mL甲醇,超聲(工作頻率80kHz,功率250W)30min,4900r/min離心10min,取上清液置50mL量瓶中,殘渣加甲醇洗滌兩次,每次5mL,同前離心,合并上清液,加甲醇定容,搖勻。即得。2.4.3積極回歸分析精密稱取該貯備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL置于10mL量瓶中,加甲醇溶解定容至刻度,搖勻,制得混合對照品溶液系列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。取10μL進樣,測定,以對照品質(zhì)量濃度對峰面積平均值作圖,結(jié)果經(jīng)回歸分析,6-gingerol在30.02~480.32μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=5582.2X-39667,r=0.9999;8-gingerol在3.76~60.16μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=5764.4X-1452.8,r=0.9999;6-shogaol在0.74~11.84μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=14856X+1590.4,r=0.9998;10-gingerol在4.52~72.32μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=5837.7X-7859.6,r=0.9998。2.4.4精密度測試2.4.4.面積計算rsd精密吸取混合對照品溶液Ⅲ10μL進樣,重復(fù)6次,以峰面積計算RSD,結(jié)果6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的RSD分別為1.83%、1.19%、1.55%、0.53%。2.4.4.分組積分面積調(diào)查取干姜供試品溶液(海南?？?重復(fù)進樣6次,進樣量10μL,記錄所測各組分積分面積。結(jié)果6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的RSD分別為1.71%、1.40%、1.67%、1.86%。2.4.4.分組積分面積調(diào)查取炮姜供試品溶液(海南?？?重復(fù)進樣6次,進樣量10μL,記錄所測各組分積分面積。結(jié)果6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的RSD分別為0.89%、0.50%、0.87%、1.09%。2.4.5重復(fù)試驗2.4.5.-犯果中各組分質(zhì)量rsd的測定取同一批次海南?？诟山?按供試品溶液的制備方法平行制備6份,依法測定,計算各組分的量,結(jié)果6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的RSD分別為0.82%、1.41%、0.92%、1.96%。2.4.5.rsd的測定取同一批次海南?？谂诮?按供試品溶液的制備方法平行制備6份,依法測定,計算各組分的量,結(jié)果6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的RSD分別為1.88%、1.07%、1.76%、1.85%。2.4.6穩(wěn)定性試驗2.4.6.溶液穩(wěn)定性試驗新配制的干姜供試品溶液(海南?？诋a(chǎn)),分別于0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5、12h進樣9次,測定6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol峰面積,結(jié)果其RSD分別為1.81%、1.09%、1.56%、1.53%,表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.4.6.溶液穩(wěn)定性試驗新配制的炮姜供試品溶液(海南?？诋a(chǎn)),分別于0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5、12h進樣9次,測定6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol峰面積,結(jié)果其RSD分別為1.46%、1.49%、1.73%、1.79%,表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.4.7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)回收率試驗2.4.7.加樣對照品貯備液制備分別精密稱取6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol各適量,配制成含6-gingerol673.12μg/mL、8-gingerol99.92μg/mL、6-shogaol5.06μg/mL、10-gingerol179.96μg/mL的混合溶液,即為加樣對照品貯備液。精密稱取干姜(海南?？诋a(chǎn))0.5g,平行6份,精密加入上述加樣對照品貯備液5.0mL,照供試品溶液制備項下操作。結(jié)果,6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的加樣回收率分別為99.93%、99.69%、99.78%、99.87%,RSD分別為1.55%、1.61%、1.27%、1.74%。2.4.7.加樣對照品貯備液制備分別精密稱取6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol各適量,配制成含6-gingerol419.6μg/mL、8-gingerol70.4μg/mL、6-shogaol55.6μg/mL、10-gingerol145.6μg/mL的混合溶液,即為加樣對照品貯備液。精密稱取炮姜(海南?？诋a(chǎn))0.5g,平行6份,精密加入上述加樣對照品貯備液5.0mL,照供試品溶液制備項下操作。結(jié)果,6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的加樣回收率分別為99.81%、99.03%、99.27%、99.45%,RSD分別為1.56%、1.33%、1.56%、1.54%。2.4.8總生姜、炮姜的進樣、進樣取各產(chǎn)地的干姜、炮姜,照“2.4.2.2”項下操作,制成供試品溶液,取10μL進樣,以外標(biāo)法計算,每個產(chǎn)區(qū)的干姜、炮姜平行3份,每份進樣2次。結(jié)果見表4。3砂炒過程中相關(guān)多糖含量的變化取上述各產(chǎn)地的生姜,洗凈,切片,50℃干燥;打粉,過4號篩,即得。參照本課題組百合多糖測定方法,結(jié)果見表1。參照本課題組生姜中總酚測定的方法,結(jié)果見表2。3.1實驗結(jié)果表明,來自全國各產(chǎn)地的干姜與炮姜中多糖、總酚、黃酮及幾種活性成分的量差異顯著,同批次生姜炮制品中,炮姜中所含有的多糖、總酚、黃酮的量明顯高于干姜;而對幾種活性成分的量測定結(jié)果表明,炮姜中所含的6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol的量明顯低于干姜,而6-shogaol的量明顯高于干姜,這可能與在砂炒過程中,由于受高溫的影響,飲片中的相關(guān)成分