不同炮制方法對全蝎有效成分和活性的影響

不同炮制方法對全蝎有效成分和活性的影響

蝎子是動物東亞的蝎子。它具有凈化風(fēng)、凈化、通訊束、中毒和結(jié)沙的功能。其有效性主要是蝎子毒素蛋白，近年來對蝎子的研究尚不成熟。中醫(yī)臨床用的全蝎是通過清水煮烘或鹽水煮烘加工而成,經(jīng)過長時(shí)間的水煮,大量的蛋白成分變性失活或被水溶解而損失。由此可見傳統(tǒng)的全蝎加工方法不利于其有效成分的保持,導(dǎo)致藥效降低。為盡量保留全蝎的有效成分及提高其臨床療效,本實(shí)驗(yàn)采用低溫凍殺全蝎,冷凍干燥機(jī)干燥的方法加工全蝎,并對其與兩種傳統(tǒng)炮制工藝的全蝎的醇浸出物得率、水溶性蛋白含量、抗腫瘤活性進(jìn)行比較研究。1藥物、動物、儀器LGJ—10D型冷凍干燥機(jī)(北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院);日立UV—3010紫外可見分光光度計(jì);LD4—2A型低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);考馬斯亮藍(lán)G-250(生工生物工程(上海)有限公司);牛血清蛋白(生工生物工程(上海)有限公司);M211-01非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(上海博蘊(yùn)生物科技有限公司);環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號07093021)。全蝎購自蒙陰縣藥材公司,經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系王厚偉副教授鑒定為鉗蝎科動物東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch;昆明種小鼠雄性18~22g(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司),許可證號:SCXK(魯)20050017;S180荷瘤小鼠(山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。2方法和結(jié)果2.1蝎子的全加工2.1.1清水煮取活蝎50g,稱定,清水洗3遍,倒入10倍量的沸水中,隨時(shí)補(bǔ)入清水,煮3h,取出,低溫烘干或陰涼處風(fēng)干,得清水制全蝎。2.1.2生理鹽水煮取活蝎50g,稱定,清水洗3遍,倒入10倍量的15%鹽水中,隨時(shí)補(bǔ)入清水,煮3h,取出,低溫烘干或陰涼處風(fēng)干,得鹽水制全蝎。2.1.3冷凍食品取活蝎50g,稱定,清水洗3遍,待風(fēng)干后放入冰箱-24℃冷凍12h,取出低溫干燥或陰涼處風(fēng)干,得凍殺制全蝎。2.2統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果根據(jù)全蝎的鮮質(zhì)量與干質(zhì)量計(jì)算出干率(出干率=干質(zhì)量/鮮質(zhì)量),并使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表1。可見,3種加工工藝的出干率有顯著性差異(P<0.05),其中鹽水制全蝎因?yàn)楹写罅康柠}分而出干率最高,凍殺制組的出干率明顯高于清水組,可能與煮制過程中的水溶性成分流失有關(guān)。2.3蒸發(fā)液用量的確定取不同加工工藝的全蝎粗粉(20目)約2g,精密稱定,置250mL錐形瓶中,加稀醇50mL,靜置1h,稱定質(zhì)量,水浴加熱至沸,并保持微沸1h,放冷,稱定,補(bǔ)充減失的質(zhì)量,搖勻,抽濾。精密量取濾液25mL,置干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中,在水浴上蒸干后,105℃烘箱烘3h,置干燥器中30min,精密稱定,重復(fù)3次,使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表1。3種加工工藝全蝎的醇浸出物得率存在顯著性差異,其中鹽水制的全蝎最高,是由于鹽溶于稀醇所致,凍殺制組的醇浸出物得率顯著高于清水制組,可以說明凍殺制可以增加全蝎的醇浸出物得率。2.4牛血清白蛋白可溶性蛋白的測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法,以牛血清蛋白作為對照品,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=141.56X-1.1487,r=0.9993,牛血清白蛋白在0~100μg線性關(guān)系良好。精密稱取各炮制品(粗粉)2g,各稱取3份,加入40mL蒸餾水,密塞,靜置30min,恒溫振蕩器常溫振蕩1h,3500r/min離心15min后傾出上清液,沉淀加40mL蒸餾水繼續(xù)振蕩1h,離心,合并兩次上清液,定容至100mL,作為供試品溶液進(jìn)行測定,結(jié)果見表1。2.5加工工藝對蝎子sds-gail紡織機(jī)的影響2.5.1提取樣品液的制備稱取3種樣品各0.5g,加入10%醋酸乙酯的石油醚溶液浸泡10min脫脂,傾去上清液,連續(xù)操作2次,水浴揮干溶劑,加入5mL電極緩沖液超聲提取15min,12000r/min離心10min,得樣品提取液,取0.8mL提取液加入0.2mL樣品緩沖液沸水浴加熱5min,12000r/min離心10min,即得樣品液。2.5.2脫色液穩(wěn)定性試驗(yàn)配置12%的分離膠,各個(gè)樣品分別加樣10、20μL,200V恒壓電泳,將膠移入平皿中,加入20mL左右考馬斯亮藍(lán)染色液于脫色搖床上緩慢震蕩10min,棄去染液,將凝膠在水中漂洗數(shù)次,加入脫色液脫色1h。結(jié)果見圖1。由電泳圖可知,蛋白譜帶以凍殺制組最多,且?guī)У念伾钌?清水制組有幾條顏色比較淺的條帶,而鹽水制組基本上沒有可見的條帶,傳統(tǒng)加工工藝處理的全蝎蛋白損失殆盡與蛋白測定結(jié)果一致。2.6小鼠腫瘤組織病理學(xué)檢測選擇接種后7~10d狀態(tài)較好的S180荷瘤小鼠,抽吸腹水5mL,加生理鹽水稀釋至15mL即得細(xì)胞懸液。將腫瘤細(xì)胞懸液皮下接種于小鼠右前肢腋下,每只0.2mL。將60只接種腫瘤細(xì)胞的小鼠隨機(jī)分為對照組、清水制組、鹽水制組、凍殺制組和環(huán)磷酰胺組,清水制組、鹽水制組、凍殺制組分別ig蝎粉0.05g/只,對照組ig等體積的生理鹽水,陽性對照組ip環(huán)磷酰胺0.06mg/只。連續(xù)給藥12d后,將小鼠稱定質(zhì)量,處死,剝離肉瘤組織,稱質(zhì)量,并進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表2。3凍干加工對全蟹蛋白類成分的影響根據(jù)醇浸出物測定結(jié)果可知,3種加工方法的醇浸出物得率有顯著性差異,其中鹽水煮制全蝎的浸出物得率最高,因?yàn)辂}制全蝎中含有大量的鹽分。蛋白量測定結(jié)果顯示,經(jīng)凍干加工處理過的全蝎蛋白的量是傳統(tǒng)炮制方法的20倍左右,可見傳統(tǒng)加工方法的煮制過程已經(jīng)使全蝎的蛋白類成分損失殆盡,經(jīng)抗腫瘤活性證實(shí),凍殺制全蝎的抗腫瘤活性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)炮制方法。全蝎作為療效確切的中藥,應(yīng)用十分廣泛