lcmsms法測(cè)定大鼠血漿和尿液和膽汁中氯沙坦的濃度

lcmsms法測(cè)定大鼠血漿和尿液和膽汁中氯沙坦的濃度

氯沙坦，2-硝基-4-氯-1-醇[2-ii]（1-4-基）-4-硝基甲基酯-5-甲醇鉀鹽，口服有效的非基因血管緊張素抗劑基型。這是一種低相對(duì)分子質(zhì)量的低異質(zhì)藥物。該藥物具有良好的口服效果，可以選擇性地與at1藥物（at1）結(jié)合，對(duì)at1藥物的選擇性親和力比at1具有30萬倍，并且沒有內(nèi)部活性。對(duì)于氯沙坦在生物介質(zhì)中的含量測(cè)定在國內(nèi)鮮有報(bào)道,在國外有相關(guān)報(bào)道[5,6,7,8,9,10,11,12,13,14]。檢測(cè)方法有高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法。高效液相色譜法用紫外線作為檢測(cè)器,但是檢測(cè)靈敏度低,最低檢測(cè)限為10μg/L,所用血漿體積需要0.5ml,用量較大。為解決靈敏度低的問題,有用熒光作為檢測(cè)器,但是,所需血漿和尿液的用量也很大,而且為消除生物介質(zhì)對(duì)于樣品的干擾,樣品的分析時(shí)間都較長。近來,液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)在生物介質(zhì)中藥物檢測(cè)方面的應(yīng)用越來越多,主要因?yàn)橐嘿|(zhì)聯(lián)用可以提高分析的靈敏度和選擇性,大大簡化前處理步驟和樣品分析時(shí)間。利用液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)氯沙坦在生物介質(zhì)中的含量在國外也有相關(guān)報(bào)道,最低檢測(cè)限達(dá)1μg/L,生物樣品前處理用固相萃取,但是血漿用量為0.4ml,回收率較低,懷疑是離子源內(nèi)的離子抑制引起,但是相關(guān)研究沒有考察基質(zhì)效應(yīng),有的方法線性范圍為400倍。也有研究用液-液萃取作為前處理方法,血漿用量降低到0.1ml,最低檢測(cè)限為1μg/L,線性范圍為500倍,但是用液-液萃取和固相萃取作為前處理方法,處理過程較為煩瑣。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)大鼠血漿﹑尿液和膽汁中氯沙坦的含量,并用沉淀蛋白處理血漿,并進(jìn)行了大鼠靜脈藥代動(dòng)力學(xué)行為和膽汁、尿液排泄的研究。1材料和方法1.1儀器和檢測(cè)方法液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(含在線脫氣機(jī),高壓梯度泵,柱溫箱,CTC自動(dòng)進(jìn)樣器,API4000Q-Trap質(zhì)譜,Agilent1100液相系統(tǒng),Analysit1.4.1色譜工作站);Eppendorf5810R全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī);EGLA公司純水儀;IKAVIBRAVXRbasic振蕩器;Tomtech自動(dòng)移液系統(tǒng)。氯沙坦鉀對(duì)照品(批號(hào)F0D287,純度為99.8%,USP);纈沙坦(內(nèi)標(biāo),批號(hào)H0G139,純度為100%,USP)。乙腈、甲酸為色譜純(TediaCompany,Inc.,USA),其余試劑為分析純,水為去離子水。1.2流動(dòng)相que-pcr色譜柱:AgelaVenusilMP-C182.1mm×50mm,粒徑5μm(Agela公司);流動(dòng)相A為0.1%甲酸,流動(dòng)相B為0.1%甲酸(溶劑為乙腈),梯度洗脫(流動(dòng)相B從0～1.5min內(nèi)由20%升到95%);流速0.350ml/min;進(jìn)樣量為10μl。1.3多離子反應(yīng)檢測(cè)mm方式離子源為電噴霧離子化(ESI)源,正離子方式檢測(cè),噴霧電壓為5.5kV,離子源溫度為550℃,霧化氣為413kPa,輔助氣為413kPa,去簇電壓為36kV,碰撞電壓為31kV;檢測(cè)方式為多離子反應(yīng)檢測(cè)(MRM)方式。用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z423.4→m/z207.2(氯沙坦,[M+H]+),m/z436→m/z235(內(nèi)標(biāo),纈沙坦,[M+H]+)。1.4溶液制備1.4.1配制成濃度為1.0g/l的儲(chǔ)備液精密稱取氯沙坦鉀對(duì)照品3.50mg,置10ml玻璃瓶中,用3.20ml的50%甲醇溶解,配成濃度為1.00g/L的儲(chǔ)備液。用50%甲醇將該儲(chǔ)備液稀釋成用來配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控的對(duì)照品系列溶液,標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液濃度為0.02、0.04、0.2、1.0、2.0、10.0、20.0mg/L,質(zhì)控工作液的濃度為0.06、1.0、16.0mg/L。溶液置于4℃冰箱中,保存待用。1.4.2配制成儲(chǔ)備液精密稱取纈沙坦對(duì)照品2.40mg,置10ml玻璃瓶中,用2.40ml的50%甲醇溶解,配成濃度為1.00g/L的儲(chǔ)備液。用50%甲醇將該儲(chǔ)備液稀釋成100μg/L的內(nèi)標(biāo)工作液,溶液置于4℃冰箱中,保存待用。1.5樣品的制備1.5.1內(nèi)標(biāo)工作液制備取待測(cè)雄性SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)血漿樣品50μl,加入96孔板中,依次加入內(nèi)標(biāo)工作液30μl、乙腈220μl,渦流混合10min,3220×g,離心10min,移去上清液50μl于另一96孔板中,加入250μl水(含0.1%甲酸),混合后待測(cè)。1.5.2乙酸乙腈溶液100μl尿液或膽汁用200μl0.1%甲酸酸化,充分搖勻后,取60μl并加入60μl的內(nèi)標(biāo),再加入440μl乙酸乙酯,渦旋混合30min后離心(3220×g/4℃/15min),移取上清150μl,旋干后,用220μl的30%乙腈(含0.1%甲酸)復(fù)溶,待測(cè)。2結(jié)果2.1方法研究2.1.1大鼠血漿、汁液和內(nèi)標(biāo)物的色譜圖取大鼠空白血漿、尿液和膽汁,除不加內(nèi)標(biāo)溶液外,其余按“1.5樣品的制備”項(xiàng)下操作,獲得空白樣品的色譜圖(圖1A、2A、3A);將一定濃度的氯沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入大鼠的空白血漿、膽汁或尿液中,同法操作,獲得相應(yīng)的色譜圖(圖1B、2B、3B);同法得到給藥后血漿、膽汁和尿液樣品的色譜圖(圖1C、2C、3C),氯沙坦和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別約為1.66min和1.90min。結(jié)果表明血漿、尿液和膽汁中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氯沙坦和內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定。2.1.2空白基質(zhì)的萃取離子圖譜的建立采用柱后灌注法考察化合物的基質(zhì)效應(yīng)。取大鼠空白血漿、尿液和膽汁,除不加內(nèi)標(biāo)溶液外,其余按“1.5樣品的制備”項(xiàng)下操作,獲得空白樣品的提取液,將提取液和空白溶劑(30%乙腈)分別進(jìn)樣進(jìn)行液質(zhì)分析,同時(shí)利用注射泵將100μg/L的氯沙坦溶液通過色譜柱與質(zhì)譜接口之間的三通,泵入質(zhì)譜的離子源。通過調(diào)節(jié)液相方法,改善色譜分析條件,最后在本方法下,將空白基質(zhì)和空白溶劑的萃取離子圖譜相比,在化合物出峰位置,空白基質(zhì)的萃取離子圖譜的響應(yīng)信號(hào)沒有明顯的增加或減弱。結(jié)果表明,本法并不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。2.1.3樣品制備和加標(biāo)回歸方程取空白基質(zhì)(血漿、尿液、膽汁)95μl,精密加入不同濃度的對(duì)照品溶液5μl,使氯沙坦在血漿、膽汁和尿液中的濃度分別為1、2、10、50、100、500、1000ng/ml。按照“1.5樣品的制備”項(xiàng)下方法操作。以基質(zhì)中氯沙坦?jié)舛?X)為橫坐標(biāo),氯沙坦與內(nèi)標(biāo)的峰面積比(Y)為縱坐標(biāo),采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得回歸方程如下:血漿中氯沙坦,Y=0.0554X+0.0239(r=0.9961,n=6);尿液中氯沙坦,Y=0.0153X+0.0041(r=0.9939,n=6);膽汁中氯沙坦,Y=0.0159X+0.0128(r=0.9966,n=6)。結(jié)果表明氯沙坦在1～1000ng/ml內(nèi),線性良好,最低檢測(cè)限為1ng/ml(在3種基質(zhì)中,S/N>5)。2.1.4精密度和準(zhǔn)確度制備氯沙坦血漿、膽汁和尿液低、中、高3個(gè)濃度(3、50、800ng/ml)的質(zhì)控樣品,用當(dāng)日隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定,每一濃度做5份,連續(xù)測(cè)定3d,計(jì)算日內(nèi)和3個(gè)日間的精密度(RSD%)和準(zhǔn)確度(RE%)。結(jié)果,本法日內(nèi)和日間精密度均<15%,準(zhǔn)確度RE%在-9.5%～11.4%之間,均滿足生物樣品分析的要求。2.1.5提取回收率b制備氯沙坦血漿、膽汁和尿液低、中、高3個(gè)濃度(3、50、800ng/ml)的質(zhì)控樣品,按照“1.5樣品的制備”項(xiàng)下方法操作,得樣品峰面積A1,每個(gè)濃度5個(gè)樣本;另取超純水95μl,加入5μl氯沙坦3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,使其濃度與質(zhì)控樣品相同,按“1.5樣品的制備”項(xiàng)下操作,得樣品峰面積A2,從而求得血漿、膽汁和尿液中氯沙坦的提取回收率(A1/A2)。結(jié)果血漿中回收率86.9%～109%,膽汁中80.9%～87.9%,尿液中83.8%～86.0%(n=5)。2.1.6氯沙坦樣品穩(wěn)定性的測(cè)定分別配制氯沙坦血漿、膽汁和尿液低中高3個(gè)濃度(3、50、800ng/ml)的樣品,每個(gè)濃度各3份,分別考察上述樣本在室溫放置24h、經(jīng)3次凍融循環(huán)及-20℃冷凍保存4周的穩(wěn)定性,結(jié)果表明,氯沙坦樣本在上述條件下均穩(wěn)定,其測(cè)定準(zhǔn)確度在規(guī)定的85%～115%內(nèi)。2.2大靜脈氯沙坦后的藥物動(dòng)力學(xué)研究2.2.1股靜脈給藥組清潔級(jí)SD大鼠3只,雄性,體質(zhì)量200～250g,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。氯沙坦用生理鹽水(NS)注射液配制得到2mg/ml自制注射液,用于大鼠股靜脈給藥(2mg/kg)。分別于給藥前及給藥后2、5、10、30min及1.0、3.0、5.0、8.0、10.0、24.0h頸動(dòng)脈取血0.35ml,置肝素處理的1.5ml塑料離心管中,取血后補(bǔ)充等量生理鹽水,血樣采集后立即以3220×g離心15min分離血漿,然后置于-80℃冰箱中保存。2.2.2采用氯沙坦用水溶液聯(lián)合乳化藥,制備大鼠股靜脈給藥,用于采集新生兒的新生兒和大鼠股靜脈給藥清潔級(jí)SD大鼠3只,雄性,體質(zhì)量200～250g,禁食過夜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。腹腔注射戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉,背位固定,沿腹白線剪開,暴露膽總管實(shí)施膽管插管手術(shù),用于引流收集膽汁。氯沙坦用生理鹽水(NS)注射液配制得到2mg/ml自制注射液,用于大鼠股靜脈給藥(2mg/kg)。收集給藥后0～2、2～4、4～8、8～24h的膽汁,膽汁收集過程中用于盛放膽汁的塑料離心管應(yīng)置于濕冰中,收集完畢后置于-80℃冰箱中保存。2.2.3不同代謝籠里,混合蝦沙坦清潔級(jí)SD大鼠3只,雄性,體質(zhì)量200～250g,分別飼養(yǎng)在代謝籠里,收集空白尿液。1d后股靜脈注射氯沙坦2mg/kg。收集給藥后0～2、2～4、4～8、8～24h的尿液,置于-80℃冰箱保存。2.2.4血漿、新生兒、山肉的時(shí)間曲線3只大鼠股靜脈注射氯沙坦后血漿中藥物濃度-時(shí)間曲線見圖4,24h血漿、膽汁、尿液中的分布見表1。結(jié)果表明,建立的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可用于測(cè)定大鼠血漿、尿液和膽汁中氯沙坦含量。3基質(zhì)效應(yīng)的確認(rèn)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)由于其高選擇性和高靈敏度,現(xiàn)已成為新藥研發(fā),尤其是藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)研究不可或缺的有力工具。其中以電噴霧(ESI)方式應(yīng)用最為廣泛。但是近幾年,與液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜法有關(guān)的基質(zhì)效應(yīng)逐漸引起人們的關(guān)注。有關(guān)基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的原因,一般認(rèn)為可能源于待測(cè)組分與生物樣品中的基質(zhì)成分在霧滴表面離子化過程的競爭,也有人認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)是由于待測(cè)組分與基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)共洗脫而引起的。目前報(bào)道的確認(rèn)基質(zhì)效應(yīng)的方法有2種:一種是標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定法,另一種方法是利用柱后灌注技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。通過柱后灌注技術(shù)測(cè)定,本研究采用的方法沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng)。本研究的血漿、膽汁和尿液的前處理方法中均使用了96孔板和自動(dòng)移液系統(tǒng),與傳統(tǒng)的單個(gè)樣品處理相比,可大大節(jié)省處理時(shí)間,提高樣品通量,提高工作效率。同時(shí)由于尿液和膽汁中含有較多的鹽,經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用沉淀蛋白作為預(yù)處理方式,信號(hào)有明顯的離子抑制,所以采用了液-液萃取方法。本實(shí)驗(yàn)液相采用了梯度洗脫方法,首先可以改善峰形,減少前沿和拖尾,提高靈敏度;其次可以縮短極性差別較大化合物分離時(shí)間;再次梯度洗脫也是很好的柱子清洗技術(shù),尤其對(duì)于洗脫鹽和小量的蛋白等。但是,梯度洗脫也需要再平衡時(shí)間,這點(diǎn)限制了它的應(yīng)