液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中氯諾昔康的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中氯諾昔康的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

氯諾比妥是一種非體抗炎藥物，具有強(qiáng)烈的抗炎性和鎮(zhèn)痛作用，可用于急性疼痛（如急性腰痛、下背部疼痛和術(shù)后疼痛）或慢性炎癥疼痛（如骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）。氯諾昔康與其他昔康類藥物相比,明顯的差異是其消除半衰期較短。有關(guān)生物樣品中氯諾昔康的含量測(cè)定方法,文獻(xiàn)報(bào)道均采用高效液相色譜法檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)建立一種快速測(cè)定人血漿中氯諾昔康的液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,并用于氯諾昔康的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。baxwdb-c8柱儀器美國(guó)Finnigan公司TSQ型液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有大氣壓化學(xué)離子化源(APCI)及Xcalibur1.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);美國(guó)Agilent公司HP1100自動(dòng)進(jìn)樣器;日本島津公司LC-10AD高效液相色譜輸液泵;美國(guó)Zymark公司TurboVap蒸發(fā)儀。藥品與試劑氯諾昔康對(duì)照品(含量99.5%),北京上地新世紀(jì)生物醫(yī)藥研究所提供;吡羅昔康對(duì)照品(內(nèi)標(biāo),含量>99%),購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;可塞風(fēng)片(氯諾昔康片,奈科明奧地利有限公司生產(chǎn),規(guī)格:8mg/片,批號(hào):213464);空白人血漿由沈陽(yáng)中心血站提供。色譜條件色譜柱為ZorbaxXDB-C8柱(150mm×4.6mmID,5μm,美國(guó)Agilent公司);流動(dòng)相為甲醇-水-甲酸(80∶20∶0.5);流速0.7mL·min-1,柱溫20℃。質(zhì)譜條件離子源為大氣壓化學(xué)離子化源(APCI源),電暈放電電流為4.0μA,加熱毛細(xì)管溫度為250℃,氣化室溫度為450℃;鞘氣(N2)流速768kPa,輔助氣(N2)流量3L·min-1;正離子方式檢測(cè);掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM);碰撞氣(Ar)壓力1.9Pa。碰撞誘導(dǎo)解離(CID)電壓為25eV;用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z372→121(氯諾昔康)和m/z332→121(吡羅昔康)。掃描時(shí)間為0.3s。血漿樣品處理取血漿0.5mL置于10mL具塞試管中,依次加入甲醇50μL,內(nèi)標(biāo)溶液(3.0mg·L-1吡羅昔康甲醇溶液)50μL和3mol·L-1磷酸100μL,混勻;加提取溶劑正己烷-二氯甲烷-異丙醇(300∶150∶15)3mL,渦流1min,振搖10min,離心5min,分取上層有機(jī)相于另一試管中,40℃空氣流下吹干,殘留物加200μL流動(dòng)相溶解,渦流混合,取20μL進(jìn)樣。在藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用19名受試者于試驗(yàn)前一天20∶00開始禁食,試驗(yàn)當(dāng)日7∶00空腹po氯諾昔康片1片(含氯諾昔康8mg),服藥后2和5h進(jìn)食統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)餐。采血期間禁煙酒和含咖啡因類飲料。于服藥前和服藥后0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,6.0,8.0,10.0,13.0和24.0h于前臂靜脈取血4mL,移入經(jīng)肝素處理的試管,離心,分離血漿,于-20℃保存至測(cè)定。達(dá)峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為實(shí)測(cè)值,對(duì)藥-時(shí)曲線進(jìn)行對(duì)數(shù)線性回歸求得消除速率常數(shù)(Ke),消除半衰期為T1/2=ln2/Ke,采用梯形法計(jì)算曲線下面積(AUC0-t和AUC0-∞)。CL=Dose/AUC0-∞,Vd=CL/Ke。結(jié)果1康和內(nèi)標(biāo)吡羅思想氯諾昔康和內(nèi)標(biāo)吡羅昔康在APCI離子化方式下,主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰,分別為m/z372和m/z332。選擇準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(圖1),氯諾昔康和內(nèi)標(biāo)吡羅昔康生成的主要碎片離子均為m/z121,將其作為定量分析時(shí)監(jiān)測(cè)的產(chǎn)物離子。以該法獲得的色譜圖具有高度專屬性。分別取6名受試者的空白血漿0.5mL,除不加內(nèi)標(biāo)外,按“血漿樣品處理”項(xiàng)下依法操作,進(jìn)樣20μL,得色譜圖,如圖2A;將一定濃度的氯諾昔康標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)加入空白血漿中,依同法操作,得色譜圖,如圖2B(a為氯諾昔康,b為內(nèi)標(biāo))。氯諾昔康和內(nèi)標(biāo)吡羅昔康的保留時(shí)間約為2.8min。取受試者給藥后的血漿樣品,依同法操作,得色譜圖,如圖2C。結(jié)果表明,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氯諾昔康和內(nèi)標(biāo)吡羅昔康的測(cè)定。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取空白血漿0.5mL,加氯諾昔康標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50μL,配制成相當(dāng)于血漿濃度為2.0,5.0,15.0,50.0,100.0,200.0,500.0,1000和1600μg·L-1的樣品,按“血漿樣品處理”項(xiàng)下依法操作,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)物濃度(X)為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo),用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得的直線回歸方程為:Y=2.34×10-4+2.075×10-3X,r2=0.9986。氯諾昔康的線性范圍為2.0～1600.0μg·L-1,定量下限為2.0μg·L-1。3準(zhǔn)確度與精密度取空白血漿0.5mL,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下制備氯諾昔康低、中、高3個(gè)濃度(分別為5.0,100.0和1000μg·L-1)的質(zhì)量控制(QC)樣品,6樣本分析,連續(xù)測(cè)定3d,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行,以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度,將結(jié)果進(jìn)行方差分析,求得本法的準(zhǔn)確度與精密度,數(shù)據(jù)見表1。數(shù)據(jù)表明該方法符合有關(guān)國(guó)際規(guī)范要求。4提取回收率按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下的方法制備低、中、高3個(gè)濃度(分別為5.0,100.0和1000μg·L-1)的血漿樣品;同時(shí)另取空白血漿0.5mL,按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作,于上清液中加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各50μL,渦流混合,40℃空氣流下吹干。殘留物以流動(dòng)相溶解,進(jìn)樣分析。以每個(gè)濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。3種濃度下樣品的提取回收率分別為72.8%,78.5%和72.6%。內(nèi)標(biāo)溶液經(jīng)同樣提取處理,其提取回收率為84.8%。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),氯諾昔康經(jīng)提取后在室溫放置12h穩(wěn)定。5質(zhì)控樣品的整體取未知血漿樣品測(cè)定時(shí),每天建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí)分析低、中、高(雙樣本)的質(zhì)控樣品,根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求算未知樣品濃度和質(zhì)控樣品濃度,決定當(dāng)日數(shù)據(jù)的取舍。對(duì)某些濃度超過(guò)定量上限的樣品,用空白血漿稀釋后進(jìn)行復(fù)檢。6血藥濃度結(jié)果對(duì)19名中國(guó)男性健康受試者單劑量po氯諾昔康8mg后血藥濃度進(jìn)行了測(cè)定。其中1名受試者表現(xiàn)出異常的藥動(dòng)學(xué)行為,其Cmax為1.4mg·L-1,Tmax為2h,服藥后24h血藥濃度仍然很高(1.01mg·L-1),AUC0-∞為189.5mg·h·L-1,其消除半衰期達(dá)到了105h。圖3給出了其他18名受試者po氯諾昔康8mg后,氯諾昔康的平均血漿濃度-時(shí)間曲線;主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。血漿藥物的提取和測(cè)定方法氯諾昔康自人體內(nèi)消除的速度,比已有的昔康類非甾體類抗炎藥都快,有文獻(xiàn)報(bào)道其在白人受試者體內(nèi)的T1/2為3～5h,這就要求測(cè)定生物樣品中氯諾昔康的濃度時(shí),需要更寬的線性范圍和更高的靈敏度。SuwaT等報(bào)道了同時(shí)測(cè)定人血漿中的氯諾昔康及其5′-羥基代謝物的HPLC-電化學(xué)檢測(cè)法,用二氯甲烷分兩次提取,當(dāng)血漿用量為100μL時(shí),氯諾昔康的定量限可達(dá)到5μg·L-1。該方法靈敏度較好,但是提取步驟較繁瑣,并且加二氯甲烷提取后,有機(jī)相在下層,操作不便。另有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC-UV測(cè)定血漿和關(guān)節(jié)滑液中的氯諾昔康,實(shí)驗(yàn)中比較了兩種提取方法,一種是采用Extrelut-1柱進(jìn)行液-液萃取,當(dāng)血漿用量為0.5mL時(shí),定量下限為10μg·L-1;另一種是用C18柱進(jìn)行固相萃取,可同時(shí)檢測(cè)氯諾昔康及其5′-羥基代謝物。本文建立了一種簡(jiǎn)便而靈敏的液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,血漿樣品用量較少,預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)單,平均提取回收率較好且穩(wěn)定,定量下限為2μg·L-1,已可滿足測(cè)定的需要。LC/MS/MS技術(shù)具有高選擇性:內(nèi)標(biāo)吡羅昔康和氯諾昔康有相近的保留時(shí)間和相同的碎片離子,氯諾昔康的離子反應(yīng)為m/z372→121,吡羅昔康為m/z332→121,由于母離子不同,SRM可以同時(shí)對(duì)兩個(gè)離子反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在選定的色譜條件下,每個(gè)樣品的色譜分析時(shí)間僅為3.3min,每天可分析100多個(gè)樣品。該法靈敏度和線性范圍均優(yōu)于文獻(xiàn)方法,適用于臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。氯諾昔康進(jìn)入人體后,在肝臟中受CYP2C9酶的催化生成5′-羥基氯諾昔康,是其主要代謝途徑。由于缺乏5′-羥基氯諾昔康的對(duì)照品,作者無(wú)法對(duì)其進(jìn)行定量。但本實(shí)驗(yàn)