uplc法測定姜中姜酚類成分的含量

uplc法測定姜中姜酚類成分的含量

生姜是姜科植物的一種干燥的葉子。它具有加熱和散寒、回陽通脈、除濕和排泄粘液的功效。姜酚(gingerol)是干姜中的辣味物質(zhì),也是干姜的主要有效部位之一,現(xiàn)代醫(yī)學研究證實,姜酚具有抗氧化,抗?jié)?刺激血液循環(huán),抗癌防衰等多種藥理作用。姜酚的種類有十多種,其中含量較高的為6姜酚、8姜酚、10姜酚。由于姜酚類化合物化學性質(zhì)不穩(wěn)定,易受酸、堿、熱等因素影響,給姜酚的提取分離和含量測定帶來了較大難度,因此對干姜總酚的提取工藝進行系統(tǒng)考察具有一定的理論和實際意義。干姜姜酚的提取工藝前人已有報道,但多只以干姜中某一種姜酚類成分為指標,多指標的提取工藝優(yōu)選實驗尚未見報道。本實驗以6、8、10姜酚的總含量為指標,比較不同提取方法和不同提取溶劑對姜酚類成分的提取效果,并進一步采用正交設(shè)計法考察姜酚類成分的最佳提取工藝,以期為干姜的進一步利用和開發(fā)提供實驗依據(jù)。1儀器和試劑盒1.1超聲清洗器、粉碎機WatersAcquityH-ClassUPLC超高效液相色譜儀,包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器以及Empower2工作站(美國Waters公司);KQ3200DB型超聲清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司);DZF6050型真空干燥箱(上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠);SQ2119B型多功能食品粉碎機(上海帥佳電子科技有限公司);滲濾裝置(自制)。1.2姜酚質(zhì)量分析姜酚對照品批號分別為:6姜酚(23513-146)、8姜酚(23513-088)和10姜酚(23513-157)購于鼎瑞化工(上海)有限公司,經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光譜檢測確認其結(jié)構(gòu),按本方法色譜條件,歸一化法測得6、8、10姜酚純度分別為98.79%、98.81%和99.13%。干姜樣品(安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥庫房提供,經(jīng)本文通訊作者鑒定為姜科植物姜(ZingiberofficinaleRosc.)的根莖,粉碎后過40目篩備用);乙腈為色譜純(美國TEDIA公司);乙醇、醋酸等試劑均為分析純;屈臣氏蒸餾水;0.2μm微孔濾膜(上海陸納生物科技有限公司)。2方法和結(jié)果2.1流動相及色譜柱WatersAcquityH-ClassUPLC超高效液相色譜儀,包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器以及Empower2工作站(美國Waters公司);色譜柱:AcquityBEHC18(2.1mm×50mm,1.8μm);流動相:乙腈-0.1%醋酸水溶液,梯度洗脫程序:0~1.0min,50∶50;1~2.5,50∶65;2.5~4.0,65~70;4.0~6.0,70~100;6.0~8.5,100∶0;8.5~9.0,50∶50(v∶v);流速為0.30mL·min-1;檢測波長:280nm;柱溫:30℃。在上述色譜條件下6、8、10姜酚的分離度較好,6、8、10姜酚混合對照品、及干姜樣品UP-LC色譜圖見圖1。2.2溶液的制備2.2.1對照品儲備液分別精密稱取6、8、10姜酚對照品各10mg左右,置50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,作為對照品儲備液;分別取對照品儲備液各1.0mL置10mL容量瓶中,作為對照品稀釋液;再分別取對照品稀釋液2.5、0.5、1.0mL,置于同一10mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,得質(zhì)量濃度為0.08905、0.01382、0.0342mg·mL-1的6、8、10姜酚的混合對照品溶液。2.2.2不同溶劑對干法提取液中控制液干性率的影響取干姜粗粉10g,分別加入10倍量的水,50%乙醇,70%乙醇,95%乙醇和甲醇,采用超聲法對樣品處理得到干姜提取液,取干姜提取液1.0mL至10mL容量瓶中,定容即得干姜樣品溶液。2.3方法研究2.3.1線性關(guān)系的考察結(jié)果表明6、8、10姜酚分別在0.0891~0.5343μg,0.0138~0.0829μg,0.0342~0.2052μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.3.2儀器精密度試驗精密吸取對照品溶液各1μL,自動進樣6次,按“2.1”所述色譜條件測定,記錄峰面積并計算6、8、10姜酚的RSD%(n=6)分別為0.52%,0.76%,0.57%,表明儀器精密度良好。2.3.3溶液穩(wěn)定性測定精密吸取同一樣品溶液分別在第0,2,4,8,12,24h進樣測定,結(jié)果6、8、10姜酚的峰面積RSD%(n=6)分別為0.31%,0.86%,0.97%,表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.4重復(fù)性試驗按“2.2.2項下”方法,以95%乙醇為溶劑,制備取6份樣品,各精密吸取1μL,自動進樣測定,結(jié)果6、8、10姜酚的峰面積RSD%(n=6)分別為0.34%,1.66%,0.49%,表明重復(fù)性良好。2.3.5加樣回收率試驗取已知姜酚含量的干姜(6、8、10姜酚分別為2.347、0.803、0.787mg·g-1)樣品粉末6份,每份0.4g左右,精密稱定,置于10mL具容量瓶中,分別加入濃度為0.891mg·mL-1的6姜酚溶液1.0mL、0.138mg·mL-1的8姜酚溶液1.5mL、0.342mg·mL-1的10姜酚1.0mL,按“2.2.2項下”超聲法制備供試品溶液,進樣1μL,按“2.1項下”色譜條件測定,并計算回收率,6、8、10姜酚的平均回收率分別為98.12%、98.64%和97.85%,RSD%分別為2.18%、1.86%和1.76%,具體結(jié)果見表2。3姜酚類物質(zhì)的提取3.1提取溶媒、提取溶劑、提取時間根據(jù)姜酚類成分的理化性質(zhì),分別以10倍量水,50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇,甲醇為提取溶媒,以超聲法為提取方法,對提取溶媒進行考察,超聲處理時間為30min。見表3。結(jié)果表明,提取率最高的溶媒為甲醇,95%乙醇與甲醇在提取率上相比有一定的差距,但考慮甲醇有一定的毒性,不適用于工業(yè)化生產(chǎn),故實驗選擇95%乙醇為其提取溶媒進一步進行考察。3.2提取方法的比較根據(jù)姜酚類成分對熱不穩(wěn)定的特點,本文沒有采用回流提取、索式提取等加熱提取方法,而是對超聲提取法,冷浸法和滲漉法等冷提方法提取姜酚類成分的效果進行了比較,結(jié)果見表4。結(jié)果表明,姜酚類成分收率為:滲漉>超聲>冷浸。3.3工藝優(yōu)化實驗根據(jù)表4中結(jié)果,超聲提取與滲漉提取相比,雖然時間短,但姜酚得率較低,且超聲提取對設(shè)備要求高,能耗大,難以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn);而滲漉法可以節(jié)約能源,對設(shè)備要求低,操作簡便,轉(zhuǎn)移率高,更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)溶劑和提取方法結(jié)果綜合分析,采用正交設(shè)計法,對乙醇濃度,滲漉乙醇用量以及滲漉流速3個主要因素對姜酚類成分的提取工藝影響進行進一步的優(yōu)選,具體因素水平的設(shè)計詳見表5。精確稱取干姜粗粉10g,裝入自制滲漉筒中,裝完后先向筒內(nèi)加入4倍量各濃度的乙醇溶液加蓋冷浸2h后再按L9(34)設(shè)定具體工作安排表進行實驗,測定并計算6、8、10姜酚總收率和干姜浸膏總重量。結(jié)果用極差法以及方差法進行分析詳見表6、表7、表8。由表6結(jié)果可見,根據(jù)極差R的大小,在6、8、10姜酚總收率中其影響因素順序為A>C>B,即乙醇濃度>滲漉流速>乙醇用量;在干姜浸膏總重量中其影響因素順序為A>B>C,即乙醇濃度>乙醇用量>滲漉流速。由直觀分析得,對于6、8、10姜酚總收率最佳工藝為A2B1C3,即乙醇濃度為80%,乙醇用量為8倍、滲漉流速為20mL/(kg·min);對于干姜浸膏總重量最佳工藝為A1B3C1,即乙醇濃度為70%,乙醇用量為12倍,流速為5mL/(kg·min)。由表7,表8進行方差分析可知,在6、8、10姜酚總收率中乙醇濃度、乙醇用量和滲漉流速3種因素均無顯著性,在干姜浸膏總重量中乙醇濃度和乙醇用量有顯著性,而在前面考察溶媒時未使用80%乙醇,且70%乙醇提取率低于95%乙醇,綜合極差的直觀分析,工藝選擇為12倍量的80%乙醇滲漉。由于滲漉流速都沒有顯著性,在極差分析中,滲漉流速這一因素在在干姜浸膏得率中的影響大于6、8、10姜酚總含量的影響,考慮到干姜浸膏中尚含有其他數(shù)種姜酚類成分,故可選擇5mL/(kg·min)為其最佳滲漉流速。綜上所述,篩選可得最佳乙醇滲漉工藝為A2B3C1,即藥材粗粉裝入滲漉筒中,裝完后先向筒內(nèi)加入4倍量80%的乙醇溶液,冷浸2h后,再加入剩余量80%乙醇按5mL/(kg·min)的速度滲漉,收集滲漉液即得。3.4姜酚含量測定采用正交設(shè)計確定的最佳條件進行了3批驗證實驗,即以10g干姜藥材,按最佳滲漉條件提取,收集滲漉液,按“2.1項下”色譜條件測定得6、8、10姜酚總含量分別為3.933、3.974、3.967mg·g-1;浸膏得率分別為11.58%、11.76%和11.88%。4最佳工藝驗證試驗結(jié)果正交實驗結(jié)果的直觀分析和方差分析表明各因素對姜酚類成分滲漉提取的影響大小依次為乙醇濃度>乙醇用量>滲漉流速,其中乙醇濃度對提取量有顯著影響。綜合分析得出干姜滲漉法提取的最佳工藝為:藥材粗粉,用12倍量80%乙醇滲漉,先加4倍量的80%乙醇溶液,冷浸2h后,再加入剩余量乙醇按5mL/(kg·min)的速度滲漉,收集滲漉液即得。按最佳工藝條件進行3次重復(fù)驗證試驗,結(jié)果表明該最佳工藝具有良好的重復(fù)性。超高效液相色譜(UPLC)法與高效液相色譜法(HPLC)比較具有分析時間快、靈敏度高、重復(fù)性好等特點,在中藥質(zhì)量控制和指紋圖譜建立等研究中的應(yīng)用越來越廣泛。實驗比較了AcquityBEHC18(2.1mm×100mm,1.7μm)、AcquityBEHC18(2.1mm×50mm,1.7μm)和AcquityHSST3(2.1mm×50mm,1.8μm)3種色譜柱和柱溫、流速等實驗因素,經(jīng)優(yōu)化得到本實驗的色譜條件。同時,考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸和乙腈-0.1%磷酸水4個流動相系統(tǒng)的