基因工程 課件 載體

載體什么是載體？簡單說，載體就是將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞的工具。載體應(yīng)具備的特征1.在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）2.具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點(diǎn)，供外源DNA片斷插入，同時(shí)不影響復(fù)制3.有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選4.具有較高的拷貝數(shù)，便于載體的制備載體分類按功能分：克隆載體和表達(dá)載體

按受體細(xì)胞類型分：原核載體、真核載體、穿梭載體按構(gòu)建克隆載體的DNA來源分：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒），噬菌粒載體，人工染色體載體等按工作方式分：細(xì)菌的質(zhì)粒載體、酵母的質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒DNA的衍生物。質(zhì)粒載體包括：大腸桿菌質(zhì)粒載體枯草桿菌質(zhì)粒載體酵母質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體藍(lán)細(xì)菌質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體什么是質(zhì)粒？質(zhì)粒（plasmid）是獨(dú)立于染色體外、具有自主復(fù)制能力的遺傳單位，其本質(zhì)是較小的核酸分子，大小范圍在1kb-200kb以上不等。1.很多細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)；2.是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的輔助性遺傳單位，基因組絕大部分為雙鏈環(huán)狀DNA，不同質(zhì)粒大小各異；3.大多數(shù)質(zhì)粒的宿主范圍較窄；4.已發(fā)展進(jìn)化出多種機(jī)制以維持其在細(xì)菌宿主中的穩(wěn)定的拷貝數(shù)；在不同的宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)可能不同。5.復(fù)制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)；6.常含有一些編碼對細(xì)菌宿主有利的酶的基因。細(xì)菌質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性單鏈切割連接單鏈切割連接共價(jià)閉合環(huán)形DNA（CovalentclosecircularDNAcccDNA）開環(huán)DNA（opencircular，ocDNA）線性DNA（linear，lDNA）環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同構(gòu)型

質(zhì)粒的命名

用小寫字母p代表質(zhì)粒（plasmid），在p字母后用兩個(gè)大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒?yàn)室名稱，再加上質(zhì)粒編號。如：pBR322：p表示一種質(zhì)粒，而“BR”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322為編號。

質(zhì)粒給宿主細(xì)胞的標(biāo)記

1.氨芐青霉素(Ampicillin)

2.卡那霉素(Kanamycin)

3.四環(huán)素（Tetracycline）

4.氯霉素(Chloramphenicol)5.鏈霉素（Streptomycin）

6.潮霉素（Hygromycin）質(zhì)粒的復(fù)制類型據(jù)質(zhì)粒DNA復(fù)制與宿主之間的關(guān)系分為：1.“嚴(yán)緊型（嚴(yán)謹(jǐn)）”復(fù)制控制的質(zhì)粒(stringentplamid)：拷貝數(shù)少（1-5個(gè)）；2.“松弛型”復(fù)制控制的質(zhì)粒(relaxedplasmid)：拷貝數(shù)多（10-200個(gè)）。

基因工程中的質(zhì)粒載體克隆載體(cloningvector):

使目的片段能在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制的載體;表達(dá)載體（ExpressionVector）:

使目的基因能在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)為RNA或蛋白質(zhì)的載體。穿梭載體（shuttlevector）：裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子，便于基因克隆。這類載體可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。一個(gè)合格質(zhì)粒載體的組成要素

復(fù)制起始位點(diǎn)Ori即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)：原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)?？股乜剐曰颍嚎梢员阌诩右詸z測，如Amp+，Kan+多克隆位點(diǎn)MCS：外源基因片段插入位點(diǎn)

P/E：啟動子/增強(qiáng)子Terms：終止信號加poly（A）信號：可以起到穩(wěn)定mRNA作用噬菌體載體雙鏈DNA噬菌體載體：λ單鏈DNA噬菌體載體：M13，T3，T7λ噬菌體載體λ噬菌體顆粒中的DNA是一線性雙鏈DNA分子，長48502bp，兩端各有12個(gè)堿基的5`凸出黏性末端是互補(bǔ)的。進(jìn)入細(xì)胞的λDNA通過兩端的黏性末端環(huán)化。

λ噬菌體上有些基因可被取代而不影響其生活周期。λ噬菌體載體舉例：λgt10載體λ噬菌體載體舉例：λEMBL3λ噬菌體載體主要特點(diǎn)主要有如下特點(diǎn)：(1)篩選簡便；(2)可克隆的片段大，最大可達(dá)23kb，而質(zhì)粒最大僅10kb左右；(3)轉(zhuǎn)化效率高。λ噬菌體載體是主要用于cDNA文庫構(gòu)建，也經(jīng)常用于外源目的基因的克隆。cosmid克隆載體cosmid（cossite-carringplasmid）人工構(gòu)建的含有λDNA的cos（cohesive-endsite）位點(diǎn)序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。柯斯質(zhì)粒載體pHC79的形體圖由pBR322質(zhì)粒DNA與λ噬菌體DNA的cos位點(diǎn)及其控制包裝作用的序列構(gòu)成1.具有

噬菌體的特性：cosmidvector的特點(diǎn)

克隆外源DNA后可以體外包裝成噬菌體顆粒。在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNA（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌

）。2.具有質(zhì)粒載體的特性：大多帶有pMB1或ColE1的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。3.高容量的克隆能力：45kb（最少不能低于30kb）。有抗生素抗性基因，和插入失活的克隆位點(diǎn)。4.方便的選擇：

將外源DNA片段插入到載體的標(biāo)記基因中使此基因失活，喪失其原有的表性特征，稱為插入失活。pBR332是研究最多，應(yīng)用最廣泛的質(zhì)粒載體之一，該質(zhì)粒有兩個(gè)標(biāo)記基因，四環(huán)素抗性基因（Tetr）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），有8種限制酶識別位點(diǎn)位于Tetr內(nèi)部，另外有2種限制酶的識別位點(diǎn)是存在于該基因的啟動區(qū)內(nèi)，在這10個(gè)限制位點(diǎn)上插入外源DNA都會導(dǎo)致Tetr的失活，這時(shí)含有DNA插入片段的pBR322將使宿主菌抗氨芐青霉素，但對四環(huán)素敏感。3種限制酶的識別位點(diǎn)位于Ampr內(nèi)，在這些位點(diǎn)插入外源DNA則會導(dǎo)致Ampr的失活，這時(shí)含有DNA插入片段的pBR322將使宿主菌抗四環(huán)素，但對氨芐青霉素敏感。插入失活是檢測重組質(zhì)粒的一種十分有效的方法

重組克隆的“插入失活”篩選方法pBR322—→插入在Tetr中，基因型為Tets

、Ampr(s-敏感，r-耐藥)——→在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長；pBR322—→插入在Ampr中，基因型為Tetr

、Amps、——→在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生長；

而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長的是非重組型。

這種在一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源DNA片段，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫插入失活。AmprTetrTetrAmpsPstI....

....涂布有Tet的培養(yǎng)基涂布有Amp的培養(yǎng)基......重組體的篩選外源基因的插入：.噬菌粒載體（phagemidvector)由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型載體系列，稱為噬菌粒（phagemid或phasmid）噬菌粒質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w輔助噬菌體大腸桿菌寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101πVXM13M13變異株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue幾種常用的噬菌粒載體的一般特征pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和pUC119噬菌粒載體的分子結(jié)構(gòu)噬菌粒載體的優(yōu)點(diǎn)1.具小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的基因基因組DNA，可克隆高達(dá)10kb的外源DNA2.有ampr等基因作為選擇記號3.拷貝數(shù)高4.存在多克隆位點(diǎn),可克隆達(dá)10kb的外源DNA5.可用組織化學(xué)顯色反應(yīng)篩選重組子6.具質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，在無輔助噬菌體存在下，克隆外源基因可按質(zhì)粒一樣復(fù)制7.有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點(diǎn)，在有噬菌體輔助感染的宿主細(xì)胞中，可合成出單鏈DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆粒分泌到培養(yǎng)基中8.可直接對克隆的基因進(jìn)行核苷酸測序人工染色體載體（artificialchromosomevecter)定義：人工染色體載體又叫大分子DNA克隆載體，利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動外源DNA片段復(fù)制的載體。其裝載外源DNA片段的容量可以與染色體的大小媲美。用來克隆大片段的DNA，不做常規(guī)克隆使用。分類：酵母人工染色體載體（YAC）細(xì)菌人工染色體載體（BAC）

P1人工染色體載體（PAC）酵母人工染色體載體（yeastartificialchromosome,YAC）YAC的特點(diǎn)：1.只能在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增2.克隆容量大，一般為200kb-500kb3.構(gòu)建原理，按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建1.自主復(fù)制序列（ARS）（autonomousreplicatingsequence）

DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ori）

染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件：TELTELCENORI2.著絲粒（centromere，cen）3.端粒（telomeres，tel）YAC的組成結(jié)構(gòu)

1.存在插入子的穩(wěn)定性問題YAC的缺點(diǎn)：同一酵母細(xì)胞內(nèi)多個(gè)YAC引起交換2.轉(zhuǎn)化效率低3.難以制備純的YAC-DNA細(xì)菌人工染色體（BAC）

基于大腸桿菌F質(zhì)粒構(gòu)建的高容量低拷貝質(zhì)粒載體?？寺⊥庠碊NA片斷：100-300kb,遠(yuǎn)大于柯斯質(zhì)粒，但小于YAC工作原理類似常規(guī)質(zhì)?？寺≥d體比較穩(wěn)定,每細(xì)胞只有一個(gè)拷貝，不會重組。

P1噬菌體載體和P1人工染色體載體

P1噬菌體：大腸桿菌的一種溶原性噬菌體。P1噬菌體載體工作原理類似黏粒載體外源片斷70-100kbP1人工染色體載體P1噬菌體載體的改造，結(jié)合了P1噬菌體載體和BAC載體的優(yōu)點(diǎn)。克隆外源片斷130-150kb克隆載體必備條件1.具有復(fù)制起點(diǎn)2.具有抗菌素抗性基因3.具有若干限制酶單一識別位點(diǎn)4.具有較小的相對分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5、四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TerColE1

6.5kb拷貝數(shù)20-30、大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124

ColE1衍生質(zhì)粒、氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的pBR322載體pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達(dá)組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。許多實(shí)用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成?？梢娖湓唾|(zhì)粒在使用上有優(yōu)點(diǎn)。組成:它由三部分組成：來自pSCl01的四環(huán)素抗性基因Tetr來自ColEl的衍生物pMBl的松弛復(fù)制起點(diǎn)ori來自RSF2124的氨芐青霉素抗性基因Ampr。

克隆載體

1.pBR322pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來源TetrAmprOri特點(diǎn):具有多個(gè)單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。Tetr中有BamH1切點(diǎn)（G↓GATCC）和SalⅠ切點(diǎn)（G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切點(diǎn)（CTGCA↓G）。

利用ColEl的復(fù)制子，在細(xì)胞中是多拷貝的。pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：

具有較小的相對分子質(zhì)量(4363bp)具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(Ampr和Tetr)具有較高的拷貝數(shù)（15個(gè),松弛型）2.pUC系列質(zhì)粒載體

特點(diǎn)具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷貝數(shù)（500-700）。具有多克隆位點(diǎn)適于組織化學(xué)方法檢測重組體pUC18pUC19含四個(gè)部分：1.來自pBR322的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ori）；2.ampr;

3.大腸桿菌β半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列；

4.多克隆位點(diǎn)（MCS）lacZ`OriAmprMCS可用組化方法鑒別：可通過插入失活法進(jìn)行篩選含有一個(gè)來自于大腸桿菌的經(jīng)過加工的LacZ基因（LacZ′），它編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個(gè)氨基酸，可以和β-半乳糖苷酶缺陷型的大腸桿菌實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，即α—互補(bǔ)，恢復(fù)分解乳糖的能力。X-gal也是β-半乳糖苷酶的一種底物，經(jīng)降解后可生成溴氯吲哚，使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。當(dāng)無β-半乳糖苷酶時(shí)，X-gal不被分解，菌落呈白色。當(dāng)外源基因插入到pUC質(zhì)粒的LacZ′基因內(nèi)部，則LacZ′基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重組體為藍(lán)色菌落。含Ampr抗性基因，可通過插入失活和顏色反應(yīng)進(jìn)行雙重篩選。表達(dá)載體的必備條件1.能自主復(fù)制2.具有方便、靈活的克隆位點(diǎn)和篩擇標(biāo)記3.具有能為

RNA聚合酶識別的強(qiáng)大啟動子4.啟動子應(yīng)可受誘導(dǎo)調(diào)控5.具有強(qiáng)終止子6.具有翻譯起始信號pGEX載體系統(tǒng)pGEX載體識別切割GST標(biāo)簽的酶pGEX-6P-1,pGEX-6P-2,pGEX-6P-3,PreScission蛋白酶pGEX-4T-1,pGEX-4T-2,pGEX-4T-3,ThrombinpGEX-5X-1,pGEX-5X-2,pGEX-5X-3,XafactorpGEX-2TKThrombin&依賴c-AMP的蛋白酶pGEX-4T-1控制區(qū)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶區(qū)Tac啟動子-10205-211β-內(nèi)酰胺酶（Ampr）基因區(qū)啟動子-101330-1335Tac啟動子-35183-188啟動子-351307-1312乳糖操縱子217-237起始密碼（ATG）1377GST核糖體結(jié)合位點(diǎn)244終止密碼（TAA）2235GST起始密碼（ATG）258LacIq基因區(qū)起始密碼（GTG）3318凝血酶切割編碼區(qū)918-935終止密碼（TGA）4398多克隆位點(diǎn)930-966質(zhì)粒復(fù)制區(qū)復(fù)制起始位點(diǎn)2995引物序列5′pGEX引物結(jié)合序列869-891復(fù)制必須區(qū)2302-29983′pGEX引物結(jié)合序列1041-1019PET系統(tǒng)：大腸桿菌中蛋白表達(dá)的金字招牌

pET載體中，目標(biāo)基因克隆到T7噬菌體強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯信號控制之下，并通過在宿主細(xì)胞提供T7RNA聚合酶來誘導(dǎo)表達(dá)。對于全世界許多研究者，Novagen的pET系統(tǒng)已成為在大腸桿菌中蛋白表達(dá)的首選。目前共包括36種載體類型、15種不同宿主菌。優(yōu)點(diǎn)

·是原核蛋白表達(dá)引用最多的系統(tǒng)

·在任何大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，基礎(chǔ)表達(dá)水平最低

·真正的調(diào)節(jié)表達(dá)水平的“變阻器”控制

·提供各種不同融合標(biāo)簽和表達(dá)系統(tǒng)配置

·可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運(yùn)和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌pET載體pET載體以pBR322為基本骨架,但彼此間的先導(dǎo)序列、表達(dá)信號、融合標(biāo)簽、限制性酶切位點(diǎn)等有所不同。pET載體大致可分為兩大類：轉(zhuǎn)錄載體和翻譯載體。轉(zhuǎn)錄載體用以表達(dá)本身帶有原核核糖體結(jié)合位點(diǎn)和AUG起始密碼子的目的基因。只有3種轉(zhuǎn)錄載體：pET-21(+)、pET-24(+)和pET-23(+)。翻譯載體包括