超氧化物歧化酶的應(yīng)用

超氧化物歧化酶的應(yīng)用

1938年，曼寧和魁21首次從牛紅細(xì)胞中分離了藍(lán)色銅氨酸。1969年，mc打破和發(fā)現(xiàn)該蛋白具有誘導(dǎo)o2和偏離反應(yīng)的功能，并將該酶稱為超級氧化物變化酶（sod，ec1.15.1）。該酶是體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑,能夠平衡機(jī)體的氧自由基,從而避免當(dāng)體內(nèi)超氧陰離子自由基濃度過高時(shí)引起的不良反應(yīng),同時(shí)SOD是一種很有用途的藥用酶。有關(guān)SOD的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,涉及到化學(xué)、生物、醫(yī)藥、日用化工、食品諸領(lǐng)域,是一個(gè)熱門研究課題。通過多年努力,在SOD的基礎(chǔ)研究方面取得了巨大成果。目前,SOD臨床應(yīng)用主要集中在抗炎癥方面(以類風(fēng)濕以及放射治療后引起的炎癥病人為主),此外對某些自身免疫性疾病(如紅斑狼瘡、皮肌炎)、肺氣腫、抗癌和氧中毒等都有一定療效;在食品工業(yè)主要用作食品添加劑和重要的功能性基料;在其它方面也有相關(guān)應(yīng)用。現(xiàn)就有關(guān)SOD的基礎(chǔ)研究進(jìn)展及應(yīng)用方面作以簡述。1sod的分類SOD是一類清除自由基的蛋白酶,對需氧生物的生存起著重要的作用,是生物體防御氧毒性的關(guān)鍵。迄今為止,科學(xué)家已從細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、藻類、昆蟲、魚類、植物和哺乳動(dòng)物等生物體內(nèi)都分離得到了SOD?；诮饘佥o基不同,這些SOD至少可以分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三種類型。一般來說,Fe-SOD是被認(rèn)為存在于較原始的生物類群中的一種SOD類型;Mn-SOD是在Fe-SOD基礎(chǔ)上進(jìn)化而來的一種蛋白類型,由于任何來源的Mn-SOD和Fe-SOD的一級結(jié)構(gòu)同源性都很高,均不同于Cu/Zn-SOD的序列,可見它們來自同一個(gè)祖先;Cu/Zn-SOD分布最廣,是一種真核生物酶,廣泛存在于動(dòng)物的血、肝和菠菜葉、刺梨等生物體中。除以上三種SOD外,Sa-OukKang等人最近又從鏈霉菌Streptomycesspp.和S.coelicotor中發(fā)現(xiàn)了兩種新的SOD,一種是含鎳酶即Ni-SOD,另一種是含鐵和鋅的酶即Fe/ZnSOD,它們均為四聚體,表觀分子量分別是13KD和22KD,它們之間沒有免疫交叉反應(yīng)。2氧氫酶反應(yīng)中的o32-和o2超氧化物歧化酶作用的底物是超氧陰離子自由基(O??22?-),它既帶一個(gè)負(fù)電荷,又只有一個(gè)未成對的電子。在不同條件下,O??22?-既可作還原劑變成O2,又可作氧化劑變成H2O2,H2O2又在過氧氫酶(Catalase,CAT)的作用下,生成H2O和O2,由此可見,有毒性的O??22?-在H2O2又在過氧氫酶(Catalase,CAT)的作用下,生成H2O和O2,由此可見,有毒性的O??22?-在SOD和CAT共同作用下,變成了無毒的H2O和O2。其作用機(jī)理如下:SOD+O??2→SOD?+O2SΟD+Ο2?-→SΟD-+Ο2SOD?+O??2?→?+2H+SOD+H2O22O??2+2H+?→?SODO2+H2O2H2O2?→?CATH2O+O2SΟD-+Ο2?-→+2Η+SΟD+Η2Ο22Ο2?-+2Η+→SΟDΟ2+Η2Ο2Η2Ο2→CAΤΗ2Ο+Ο23sod的結(jié)構(gòu)和性能3.1cuzn-sod的結(jié)構(gòu)超氧化物歧化酶(SOD)從結(jié)構(gòu)上可分為兩族:CuZn-SOD為第一族,Mn-SOD和Fe-SOD為第二族。天然存在的SOD,雖然活性中心離子不同,但催化活性部位卻具有高度的結(jié)構(gòu)同一性和進(jìn)化的保守性,即活性中心金屬離子都是與3或4個(gè)組氨酸(His)、咪唑基(Mn-SOD含1個(gè)天門冬氨酸羧基配位)和1個(gè)H2O分子呈畸變的四方錐或扭曲的四面體配位。CuZn-SOD作為SOD結(jié)構(gòu)上的第一族,是人們對于SOD結(jié)構(gòu)研究的突破口,也是人們了解最多的一種SOD。比較不同來源的CuZn-SOD的氨基酸序列可以發(fā)現(xiàn),它們的同源性都很高。有些氨基酸還很保守,在所有序列中都不變,這暗示著這些氨基酸與活性中心有關(guān)。如圖1牛紅細(xì)胞CuZn-SOD的結(jié)構(gòu)所示:每個(gè)銅原子除分別與4個(gè)組氨基酸殘基(His44.46.61.118)的咪唑氮配位外,還與一軸向水分子形成遠(yuǎn)距離的第五配位,Zn則與3個(gè)組氨酸殘基(His61.69.78)和1個(gè)天冬氨酸(D81)配位。Cu、Zn共同連接組氨酸61組成“咪唑橋”結(jié)構(gòu)。Mn-SOD和Fe-SOD同屬于SOD結(jié)構(gòu)上的第二族,Mn-SOD是由203個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的四聚體,Mn(Ⅲ)是處于三角雙錐配位環(huán)境中,其中一軸向配位為水分子,另一軸向被蛋白質(zhì)輔基的配位His-28占據(jù),另3個(gè)配基His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。Fe-SOD的活性中心是由3個(gè)His,1個(gè)Asp和1個(gè)H2O扭曲四面體配位而成。3.2主要的理化性質(zhì)SOD是一種酸性蛋白,在酶分子上共價(jià)連接金屬輔基,因此它對熱、pH以及某些理化性質(zhì)表現(xiàn)出異常的穩(wěn)定性,其主要的理化性質(zhì)見表2。從上面可以看出,Mn-SOD、Fe-SOD的結(jié)構(gòu)特征是不含半光氨酸,含有較多的色氨酸和酪氨酸,因此紫外吸收光譜類似一般蛋白質(zhì),在280nm附近有最大吸收峰,Mn-SOD的可見光譜在475nm處附近有最大吸收,Fe-SOD在350nm處有最大吸收,這都反映了所含金屬離子的光學(xué)性質(zhì)。4生物酶提取與純化sod發(fā)酵工藝目前國內(nèi)已開發(fā)的SOD產(chǎn)品絕大分都是Cu/Zn-SOD,它們最早是從動(dòng)物的血、肝中分離提取的,主要有以下幾個(gè)步驟:溶血液的制備、選擇性熱變性、超濾濃縮、丙酮沉淀、柱層析、冷凍干燥。但是由于這種方法不可避免地發(fā)生一些交叉感染,過敏性反應(yīng)等現(xiàn)象,開發(fā)研究從植物中提取SOD就顯得尤為重要。我國近年來在植物SOD的研究領(lǐng)域有大量相關(guān)報(bào)道。許平、袁藝、趙文芝、余旭亞等分別從大蒜、桑葉、沙棘、仙人掌中提取SOD并進(jìn)行了相關(guān)研究。其提取方法主要有分步鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、層析柱法等。除了從動(dòng)植物中提取SOD外,選育SOD高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)也是比較有價(jià)值的一種方法。1997年王歲樓等人自然篩選出1株SOD高產(chǎn)菌株Y-216,酶活可達(dá)600U/g濕菌體,并對其形成SOD的生理?xiàng)l件作了初步研究,為SOD的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。吳思芳等人研究了從啤酒廢酵母生產(chǎn)、提取、純化SOD的方法和條件,得到比活為3048U/mg的SOD酶,指出開展啤酒廢酵母生產(chǎn)SOD的綜合利用具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。由于天然SOD來源有限,且具有異體蛋白免疫原性,外源SOD不易被人體接受等缺陷,使之在應(yīng)用方面受到很大限制。SOD基因工程是廣開酶源,降低成本和獲得無抗原性的人源SOD的有效途徑。近年來,美、日、英、德相繼開發(fā)了微生物SOD基因工程產(chǎn)品,并進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)。我國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所和海軍總醫(yī)院分子生物學(xué)研究室已成功將人血CuZn-SOD克隆到大腸桿菌中,表達(dá)率高達(dá)50%。施惠娟等分別以人胎肝組織及人肝細(xì)胞株(L02)總RNA為模板,以RT-PCR法獲得hCuZn-SOD和hMn-SODcDNA,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pETSOD,并導(dǎo)入E.coli細(xì)胞中使之表達(dá)。分別獲得了38%和50%的高表達(dá)率,且表達(dá)的SOD有酶活性。鑒于重組的人SOD在體內(nèi)半衰期仍很短,施惠娟等又通過基因工程的方法將rhCuZn-SODcDNA基因改造得到了更加穩(wěn)定的酶。以上說明了我國人源SOD在微生物細(xì)胞中的克隆和表達(dá)已達(dá)到了國際水平。目前,國內(nèi)外在基因工程生產(chǎn)SOD方面均取得了可喜的成果。5小分子模擬化合物與天然SOD相比,SOD的模擬物有著更顯著的優(yōu)點(diǎn)。首先是獲取和制備比天然SOD要簡單得多。天然SOD要從人或其它生物中提取,這就決定了天然SOD的提取必然困難重重,而且產(chǎn)量不高。而模擬SOD可以用化學(xué)方法來人工合成,其物質(zhì)和能量消耗低,且產(chǎn)量不會(huì)受到限制。其次,天然SOD作為一種生物大分子,在進(jìn)入體內(nèi)時(shí)存在著諸如進(jìn)入細(xì)胞能力弱、細(xì)胞滲透性差、在血中半衰期短(在人體中SOD只是在很短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定,其半衰期為分鐘級)、不能口服、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。另外,對于非人體SOD還存在著造成免疫損傷的可能。所以人們把目光投向了SOD模擬物,尤其是低分子量模擬物上。目前,生物無機(jī)化學(xué)家們合成和表征了一系列含銅、錳、鐵等金屬離子的小分子配合物來模擬SOD,期待將來能用小分子模擬化合物代替SOD應(yīng)用于臨床。其中研究最多的含銅絡(luò)合物是3,5-二異丙基水楊酸銅[Cu(3,5-DIPS)],這是一種低分子量的親脂性絡(luò)合物,具有天然CuZn-SOD樣活性,可以起到抗炎及減輕由鏈脲菌素誘導(dǎo)產(chǎn)生的糖尿病。劉京萍等合成的鐵(Ⅱ)-酪氨酸模擬SOD金屬酶,分子量比天然酶小得多,與天然SOD活性差距較小,且毒性小,從而大大推進(jìn)了人工合成具有分子質(zhì)量較小、穩(wěn)定性高、毒性較底、活性較高等優(yōu)點(diǎn)的SOD模擬物的研究工作。但是由于超氧化物歧化酶的模擬屬于新型交叉學(xué)科,需要化學(xué)和生物學(xué)知識乃至技術(shù)的高度結(jié)合,目前的模擬還沒有走向成熟,相信隨著21世紀(jì)化學(xué)生物學(xué)的崛起,這一新興交叉學(xué)科將會(huì)對化學(xué)、生物學(xué)及醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。6sod的使用6.1利用天然食品作為食品的應(yīng)用與其它抗氧化劑一樣,SOD可作為罐頭食品、果汁、啤酒等的抗氧化劑,防止過氧化酶引起的食品變質(zhì)及腐敗現(xiàn)象;還可作為水果、蔬菜等的良好保鮮劑。由于絕大部分蔬菜、水果都含SOD,其中含量較高的有:刺梨、香蕉、獼猴桃、菠蘿、山楂、大蒜等,水果果皮中SOD活性明顯高于果肉,且水果SOD活性在儲(chǔ)藏期內(nèi)均呈下降趨勢。人們就充分利用這些富含SOD的原料開發(fā)天然保健食品如蘆薈汁、大蒜素、刺梨汁、菠蘿汁、麥綠素等。其中麥綠素是以大麥嫩葉為原料經(jīng)濃縮提取的。其它含SOD的食品有:食用菌、扇貝、雞、調(diào)味品等。常見食用菌中猴頭菇SOD活性較強(qiáng),達(dá)3120U/g濕菌絲。靈芝菌活性也很高,已被制成靈芝酒投放市場。常見調(diào)味品中,發(fā)現(xiàn)醬油、魚露、豆腐乳中均含SOD樣活性物質(zhì),其具體性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。另外還可以作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑加入食品中制成新的保健食品,例如綠茶飲料有預(yù)防齲齒、敏感癥、痛風(fēng)、降壓、抑制氧化等作用;番木瓜SOD酒采用低溫生物技術(shù)發(fā)酵而成,是一種低度純天然的綠色健康型果露酒,能幫助消化,消除慢性胃炎,舒張血管,降低血壓等作用。目前已開發(fā)的還有蛋黃醬、酸牛奶、可溶性咖啡、奶糖等產(chǎn)品。為擴(kuò)大SOD在食品中的應(yīng)用范圍,需增強(qiáng)SOD的穩(wěn)定性,有必要對SOD進(jìn)行化學(xué)修飾,選擇無毒副作用的物質(zhì)作為修飾劑,例如肝素化合物、硫酸軟骨素、脂肪酸等,其中由玻璃酸、月桂酸修飾的SOD已投入商品化生產(chǎn)。有研究表明,制成SOD脂質(zhì)體不僅能增強(qiáng)穩(wěn)定性,還能促進(jìn)人體皮膚的吸收。6.2治療生物免疫生化疾病正常生命過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基是維持生命所必需的,當(dāng)其濃度過高時(shí),對機(jī)體會(huì)造成損害。因此超氧化物歧化酶作為其特異清除劑,在生物體的生命活動(dòng)中具有重要意義。大量研究表明,SOD活性低下可以看作是某些疾病的特征之一。SOD是O??22?-的“克星”,具有抗炎、抗病毒、抗輻射、抗衰老等作用。在病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺血和缺血再灌流綜合癥、老年性白內(nèi)障、心血管疾病、輻射病、癌和癌的放射治療預(yù)防以及人類長壽等領(lǐng)域的研究中也己有突破性進(jìn)展。目前,SOD作為藥用酶已經(jīng)開始試用于治療關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等疾病。6.3預(yù)防口腔疾病SOD既可以作為藥用酶,也可作為化妝品的添加劑,國際生化委員會(huì),美國聯(lián)邦食品管理局稱其為“抗衰因子”、“美容嬌子”。具有抗衰老、防曬、抗炎等功效。SOD還可以加入到牙膏、漱口水、含片等中,對預(yù)防口