i標(biāo)記抗人adam15多克隆抗體在荷人胃癌裸鼠體內(nèi)的生物分布

i標(biāo)記抗人adam15多克隆抗體在荷人胃癌裸鼠體內(nèi)的生物分布

由于脾胃疾病嚴(yán)重，治療難度大，預(yù)后差。因此，尋找特定的診斷和治療非常重要。金屬蛋白酶去整合素家族(adisintegrinandmetalloproteinase,ADAM)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類跨膜糖蛋白家族,具有蛋白水解、細(xì)胞外基質(zhì)降解、生物活性因子釋放、細(xì)胞附著、融合、遷移、信號傳導(dǎo)等功能。去整合素金屬蛋白酶15(ADAM15)與人類多種實體瘤如胃癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌等的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),同時在腫瘤血管再生過程中起到必不可少的作用。本研究用125I標(biāo)記抗人ADAM15多克隆抗體(anti-ADAM15抗體),研究其在荷胃癌裸鼠體內(nèi)的分布,為應(yīng)用放射性核素標(biāo)記anti-ADAM15抗體進(jìn)行胃癌放射免疫顯像和放射免疫治療奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實驗動物及食物anti-ADAM15抗體由江南大學(xué)提供;胃癌細(xì)胞株HGC-27由本實驗室保存;BALB/c裸鼠由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供,4周齡,體質(zhì)量16～20g,SPF級環(huán)境中飼養(yǎng),恒溫25～27℃,恒濕45%～50%,飲用水及食物均經(jīng)滅菌。Na125I(成都中核高通同位素股份有限公司),氯胺-T(Sigma公司,美國),偏重亞硫酸鈉(Fluka公司,德國),SephadexG50(GE公司,美國)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1標(biāo)記物的制備取0.05mol/L、pH7.5的PB100μl加入放免試管中,然后依次加入待標(biāo)記的抗體20μl(1.2mg/ml)、2.03GBq/ml(54.9mCi/ml)Na125I溶液10μl、氯胺T溶液(2mg/ml)50μl,磁力攪拌器攪拌反應(yīng)5min;加入偏重亞硫酸鈉溶液(2mg/ml)100μl反應(yīng)1min完成標(biāo)記實驗。將反應(yīng)液用SephadexG-50柱純化,用0.05mol/L、pH7.5的PBS洗脫,收集洗脫液10滴/管,測量放射性活度。取峰值洗脫液測定純化后的標(biāo)記物放射化學(xué)純度,紙層析法測定放射化學(xué)純度,新華1號層析紙為固定相,生理鹽水為展開劑,標(biāo)記物Rf值為0.0～0.1。將洗脫液過濾備用。1.2.2設(shè)定觀察細(xì)胞測量取標(biāo)記物50μl按體積比1∶20加入生理鹽水和新鮮人血清中,封口后置入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),于1、4、8、24和48h時間點分別取出測定其放射化學(xué)純度。1.2.3balb/c裸鼠前灰創(chuàng)新細(xì)胞的接種胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞株HGC-27,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/ml,抽取細(xì)胞懸液0.2ml接種于5周齡BALB/c裸鼠右側(cè)腋窩皮下。待瘤長到直徑約為1cm時,用于SPECT顯像實驗。1.2.4spica法檢測裸鼠體內(nèi)放射性4只荷瘤裸鼠顯像前三天每天用0.1g/ml碘化鉀口服液200μl灌胃,經(jīng)尾靜脈注射125I-anti-ADAM15抗體3.7MBq(100μCi)。將裸鼠麻醉后,俯臥位固定,在注藥后1、4、8、24和48h對裸鼠進(jìn)行SPECT平面顯像。采用低能平行孔高分辨準(zhǔn)直器,能峰37keV,窗寬60%,放大倍數(shù)2.6,采集總計數(shù)為100k。制備1個標(biāo)準(zhǔn)源0.407MBq(11μCi)每次同時采集。用感興趣區(qū)(ROI)技術(shù)進(jìn)行半定量分析,計算腫瘤與非瘤組織的放射性計數(shù)比值(T/NT)和腫瘤與裸鼠全身的放射性計數(shù)比值(T/Total)。48h顯像后處死動物,取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、血、肌肉、骨、甲狀腺、胰腺和腫瘤等組織,稱重并在γ計數(shù)儀上測其放射性計數(shù),計算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。1.3統(tǒng)計處理計量數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,運用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1標(biāo)記物的放射性化學(xué)純度125I-anti-ADAM15抗體的標(biāo)記率為(75.16±9.43)%,純化后標(biāo)記物的放射化學(xué)純度為(99.44±0.21)%。標(biāo)記物加入生理鹽水和新鮮人血清后的放射化學(xué)純度如表1所示。2.2腫瘤部位顯像觀察荷瘤裸鼠右側(cè)腋下腫瘤部位在SPECT平面顯像中顯影清晰,標(biāo)記物隨時間的延長在腫瘤部位逐步濃聚(圖1)。根據(jù)ROI半定量分析所得T/NT和T/Total值如表2所示。2.3id/g血、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、骨骼、甲狀腺、腦、胰腺和腫瘤等臟器組織的每克組織百分注射劑量率(%ID/g)分別為17.47±4.07、5.22±1.54、4.78±1.50、6.98±1.10、11.08±2.55、6.25±1.50、2.75±0.79、2.88±0.90、1.95±0.79、2.70±0.97、12.75±7.56、0.51±0.09、2.81±0.65和8.59±1.49。3社區(qū)治療后12h的熱反應(yīng)anti-ADAM15抗體是以重組人ADAM15蛋白為抗原制備的,用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測它與胃癌細(xì)胞株HGC-27有結(jié)合。本研究采用氯胺T法標(biāo)記該抗體,標(biāo)記率高,純化后標(biāo)記物放射化學(xué)純度可達(dá)(99.44±0.21)%,提示標(biāo)記方法穩(wěn)定可靠。標(biāo)記物在生理鹽水中放置48h后放射化學(xué)純度仍在95%左右,提示其在生理鹽水中很穩(wěn)定。但在新鮮人血清中放置24h后放射化學(xué)純度就有下降,在48h時放射化學(xué)純度為(79.09±5.94)%,提示其在人血清中欠穩(wěn)定,有脫碘顯像,也有可能被血清中的酶分解。對荷人胃癌裸鼠進(jìn)行SPECT顯像結(jié)果顯示,隨125I-anti-ADAM15抗體靜脈注入時間的延長,瘤體內(nèi)放射性越來越高,T/NT逐步增高。在24h時腫瘤顯影清晰但全身血本底較高,在48h時T/NT可達(dá)3.84±0.43。由于125I的物理半衰期為60d,給藥后較長時間內(nèi)仍然可以進(jìn)行放射免疫顯像,但本研究中由于SPECT設(shè)備需要檢修,因此未進(jìn)一步延時顯像。48h后體內(nèi)分布實驗提示,腫瘤組織每克組織百分注射劑量率達(dá)8.59±1.49,這與顯像結(jié)果是一致的。但血液、肺和甲狀腺內(nèi)每克組織百分注射劑量率較高,提示在體內(nèi)有脫碘現(xiàn)象,與穩(wěn)定性實驗結(jié)果一致;而血液中每克組織百分注射劑量率較高,也可能是抗體與血液中蛋白結(jié)合后滯留在血液內(nèi)所致,有待于進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明,125I-anti-ADAM15抗體在荷胃癌裸鼠體內(nèi)具有腫瘤靶向定位能力,且在瘤內(nèi)滯留時間較長