小鼠黃褐斑動物實驗模型的建立

小鼠黃褐斑動物實驗模型的建立

根據(jù)“雌激素和黃體酮的增加與黑色素細胞的刺激有關(guān)，色素沉著于黃疸”的假設(shè)，黃體酮可以攻擊雌性和大鼠，復制黃褐斑動物的實驗模型。實驗材料1實驗動物昆明種小鼠,體重30g±2g,均為雌性。2l-酪氨酸溶液黃體酮注射液:20mg/ml,使用前用滅菌注射用水稀釋至所需濃度。酪氨酸儲備液:以L-酪氨酸用蒸餾水配制成0.3mg/ml的水溶液。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒:購自南京建成生物工程研究所。鼠抗人單克隆抗體HMB45(melanoma黑素瘤)即用型試劑盒:購自福建邁新公司。實驗方法1不同劑量的肌注將上述小鼠33只,隨機分為3組,每組11只。①正常組:5ml/kg滅菌注射用水肌注。②黃體酮低劑量組:2倍于人臨床等效劑量,即5mg/kg(0.1%水溶液5ml/kg)肌注。③黃體酮高劑量組:4倍于低劑量組。各組均注射于小鼠大腿根部,1日1次,兩側(cè)交替,共1個月。2不同的預處理攻擊1個月后頸椎脫臼,處死小鼠,背部去毛,取皮膚、肝臟各一塊,用預冷生理鹽水(4℃)沖洗,除凈雜質(zhì),濾紙拭干,切取皮膚、肝臟各0.5g,分別放入裝有9倍于組織塊重的預冷生理鹽水的小燒杯內(nèi),剪碎后用高速分散器粉碎、勻漿。勻漿液以3500r/min離心15min,取上清液進行相關(guān)指標的測定。3sda和sod的測量按測定試劑盒的操作要求進行。4測定氨基酸含量采用同步熒光分析法。5免疫組織化學以黃體酮高劑量組小鼠皮膚為研究對象。剝?nèi)”巢科つw一塊,去毛,10%福爾馬林固定。常規(guī)石臘包埋,連續(xù)5μm厚切片,HE染色。黑色素標記采用免疫組織化學技術(shù),選用鏈霉菌素·生物素法。一抗選用鼠抗人單克隆抗體HMB45,DAB顯色,蘇木素村染。用PBS代替一抗做陰性對照,用人體皮膚組織做陽性對照。6真彩色圖像分析各組隨機選取8只小鼠的皮膚組織塊,各制成1張病理切片,每片觀察5個互不重疊的視野,找到陽性目標(皮膚表皮和附件上皮細胞胞漿中呈現(xiàn)棕色反應)后,用CMIAS系列98A型多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)對目標圖像進行定量分析,得出每張切片5個視野及每組8只動物黑色素陽性目標的平均面積、目標與統(tǒng)計場面積之比(面密度)、目標個數(shù)與統(tǒng)計場面積之比(數(shù)密度)、平均灰度、平均光密度、積分光密度,用t檢驗方法對各組之間的數(shù)值進行統(tǒng)計學處理。結(jié)果1氨基酸含量黃體酮高劑量組皮膚、肝臟酪氨酸含量與正常組比較明顯升高,肝臟酪氨酸含量還顯著高于低劑量組(見表1)。2皮膚mda含量兩劑量組的肝MDA含量及高劑量組的皮膚MDA含量明顯升高,與正常組比較有顯著性差異。兩劑量組皮膚、肝SOD含量與正常組比較,無明顯變化(見表1)。3h需要不同標記的組織結(jié)構(gòu)正常組:鱗狀上皮較菲薄,由排列整齊的基底細胞和棘細胞組成,共2～3層,表面有少量角質(zhì)。真皮中見毛囊,皮脂腺與表皮相連,未見汗腺。皮下脂肪組織未見特殊。HMB45標記表皮中幾乎未見黑色素細胞,毛囊、皮脂腺基底細胞中見少量黑色素細胞。以人體皮膚組織HMB45標記作為陽性對照,黑色素細胞整齊排列于基底層,棘細胞層中偶見陽性細胞。模型組:HMB45標記的黑色素陽性細胞明顯增多,成簇分布于毛囊基底細胞團中,呈強陽性反應,表皮基底細胞和棘細胞層中亦見單個散在分布的黑色素細胞,伴細胞核增大及核上移。表皮細胞數(shù)增多,局部呈疣狀增生。4hmb45標記黑細胞的病理圖像分析4.1對正常組動物的色素染色面積、面密度、目標個數(shù)、數(shù)密度、核酸數(shù)目的影響模型組表皮黑色素陽性目標平均面積(黑色素染色面積)、面密度、目標個數(shù)、數(shù)密度、細胞核數(shù)目均明顯高于正常組動物,有顯著性差異,P<0.01(見表2)。4.2溫度大小對比。請分為5.一幅黑白圖像上每一點的深淺度在計算機內(nèi)可化分為0～255個等級,稱灰度值;光密度則反應物體對光的吸收率(透過率),兩者都反應物體顏色的深淺程度。顏色越深,灰度值越小;而其對光線的吸收越多,故光密度越高。積分光密度是物體的平均光密度與物體面積的乘積,顏色越深,面積越大,光密度越高。結(jié)果顯示,模型組小鼠皮膚黑色素陽性目標的平均灰度值明顯低于正常組,平均光密度和積分光密度明顯高于正常組,有顯著性差異(見表3)。討論1皮膚色素的形成黃褐斑的確切病因、發(fā)病機制目前不甚清楚,根據(jù)多數(shù)患者的性別、發(fā)病年齡等進行推斷,主要與內(nèi)分泌紊亂有關(guān)。而妊娠、哺乳、口服避孕藥、卵巢及乳腺病變等因素,導致內(nèi)分泌失調(diào),使體內(nèi)黃體酮、雌激素含量增高,刺激黑色素細胞,導致皮膚色素沉著增加。研究黃褐斑的發(fā)病機制,首先必須弄清色素沉著的機制。皮膚色素是在基底層黑色素母細胞中形成的,體外研究表明,皮膚色素的合成是酪氨酸通過酪氨酸酶的作用而緩慢地氧化成多巴,多巴又在多巴氧化酶的影響下氧化形成無色的中間質(zhì)量,這種物質(zhì)在酪氨酸酶的進一步影響下,聚并而最后氧化成棕色黑色素?？梢?酪氨酸增多為黃褐斑發(fā)病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。由于黑色素的形成是酪氨酸酶一系列氧化反應的結(jié)果,揭示體內(nèi)氧化與抗氧化之間的平衡系亂,可能是黃褐斑發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一。王氏對35例黃褐斑做LPO、SOD含量測定,有15例LPO超過正常值,占42.9%,29例SOD低于正常值,占82.9%,而7例正常人對照組各為1例異常。兩組LPO、SOD含量及陽性率有顯著性差異(P<0.01)。根據(jù)黃褐斑的發(fā)病學說及皮膚色素沉著的機制,以黃體酮(孕激素)長時間攻擊雌性小鼠,使其內(nèi)分泌失調(diào),并以肝、皮膚組織中酪氨酸、MDA、SOD含量變化及皮膚黑色素細胞增長情況為考察造模是否成功的指標。2對大鼠皮膚、肝酪氨酸含量的影響結(jié)果顯示,以2倍、8倍于人臨床等效量的黃體酮攻擊雌性小鼠1個月后,肝、皮膚的MDA含量明顯高于正常組動物,黃體酮高劑量組的皮膚、肝酪氨酸含量也明顯高于正常組及低劑量組?？梢?以8倍于人黃體酮等效劑量,注射時間1個月,可以達到升高皮膚、肝臟酪氨酸含量,并導致氧化與抗氧化之間平衡系亂的目的,它符合黃褐斑發(fā)病的生化學改變特征。3小鼠皮膚生化指標變化就黃褐斑的動物模型而言,判斷是否成功最直接、最客觀的指標,是皮膚病理學檢查黑色素沉著是否增多,它較之酪氨酸等生化指標的測定更具實際意義。結(jié)果顯示,正常組小鼠HMB45標記皮膚僅在毛囊、皮脂腺基底細胞中見少量黑色素細胞;模型組黑色素細胞明顯增多,成簇分布于毛囊基底細胞團中,呈強陽性反應。病理圖像學多參數(shù)定量分析結(jié)果顯示,模型組皮膚黑色素著色面積、深度明顯大于正常組,這從病理學角度進一步證實,用本方法制作的小鼠黃褐斑動物模型是成功的。4皮膚激素代謝小白鼠正常組和模型組皮膚HE染色病理切片在光鏡下均不能發(fā)現(xiàn)黑色素細胞,用黑色素特殊染色方法,以黑色素特染試劑對皮膚病理切片染色,仍未見黑色素顆粒。而以人體正常皮膚組織作為陽性對照的病理分析,卻可見黑色素細胞整齊排列于基底層,提示黑色