山楂葉總黃酮的體外清除活性研究

山楂葉總黃酮的體外清除活性研究

自由基包含一個或多個未成對的電子的原子、分子或離子。自由基很活潑,具有高度的化學反應活性,自由基過多或清除過慢,會加速機體的衰老進程并誘發(fā)各種疾病。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),自由基與一百多種人類疾病有關。而黃酮類化合物通過酚羥基可與自由基反應,生成比較穩(wěn)定的半醌式自由基,從而終止了自由基鏈式反應,其清除自由基的能力與其結構特別是芳香環(huán)核失電子有關。近年來,對一些黃酮類物質(zhì)清除自由基性能的相關研究發(fā)現(xiàn),不同的黃酮類化合物對自由基的清除活性有一定差異。黃酮類化合物種類較多,種類之間結構也有一定差異,因此不同的黃酮類化合物其生物活性也有所不同。山楂葉中富含黃酮類化合物,含量高達1.8%~2.0%。山楂葉黃酮在治療冠心病、心絞痛、心肌炎及高血脂病等方面有一定的效果,但有關其清除自由基活性的研究報道還很少。本文以毛山楂樹秋天的落葉為原料,提取其中的總黃酮,并以VC和蘆丁為對照品,采用DPPH(二苯代苦味酰肼自由基)體系和超氧陰離子自由基體系對山楂葉總黃酮的體外抗氧化性進行了研究,為山楂葉資源的進一步高效利用提供一定的理論依據(jù)。1材料和方法1.1自由基和二次蒸餾試驗用原料為采自東北林業(yè)大學校園的毛山楂(CrataegusmaximowicziiSchneid.)秋天落葉,陰干。試劑有蘆丁標準品和DPPH自由基,均為美國Sigma公司生產(chǎn);無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、VC、鄰苯三酚,均為分析純;二次蒸餾水為市售。主要試驗儀器有RE-52旋轉蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠)、SHB-95A循環(huán)式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)、TU-1900紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、PHS-3C酸度計(上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司)。1.2測試方法1.2.1料液比的確定粒度為0.21~0.55mm的山楂葉粉,料液比1∶10(g∶mL),用70%乙醇80℃水浴回流提取3次,每次1h;合并濾液,減壓濃縮至無醇味,蒸干,得山楂葉總黃酮。1.2.2dpph自由基清除率測定配制山楂葉總黃酮、蘆丁、VC3種待測液,質(zhì)量濃度分別為2、2、0.4mg/mL。稱取10.3mgDPPH自由基,用無水乙醇定容至250mL,溶液濃度為0.1mmol/L,將其盛于棕色容量瓶中,置于暗處保存。分別取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL各待測液,加入2mLDPPH自由基溶液,用無水乙醇將體系均補至4mL,搖勻,10min后以無水乙醇作為參比,測定不同時間各體系在517nm波長處的吸光度;將樣品用等體積水代替,即體系中僅含DPPH和無水乙醇,其他同前,測定吸光度。另將DPPH自由基溶液用等體積水代替,即體系中僅含樣品和無水乙醇,其他同前,測定吸光度。DPPH自由基的清除率計算公式K=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%式中,K為清除率;Ai為加試樣反應后DPPH溶液的吸光度;Aj為不加DPPH,只加試樣溶液的吸光度;Ac為不加試樣,只加DPPH溶液的吸光度。1.2.3反應速率的測定采用鄰苯三酚自氧化法。在25℃恒溫條件下,在10mL容量瓶中加入pH值為8.30的0.05mol/LTris-HCl溶液5.0mL、2mmol/L的鄰苯三酚0.2mL,加待測液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL(不加待測液為對照),然后再加一定量緩沖溶液至體系總體積9mL,并以二次蒸餾水做參比,鄰苯三酚最后加入,迅速混勻后用紫外可見分光光度計測定322nm波長處的吸光度,每隔1min測一次,直到反應啟動后第9min;把所得的數(shù)據(jù)以時間為橫坐標、A322值為縱坐標進行線性回歸,得到的直線斜率為反應速率V空、V樣。清除率按下式進行計算K(%)=(V空-V樣)/V空×100式中,V空為不加待測液時的反應速率;V樣為加入待測液時的反應速率。2結果與討論2.1不同加入量對dpph自由基的清除能力的影響DPPH(2,2-diphenyl-1-picry-hydrazylradical)是一種較為穩(wěn)定的自由基,分子結構中有未成對電子,其乙醇溶液呈藍紫色,在517nm處有最大吸收值。當未成對電子被其它自由基電子配對后,吸收值降低,其褪色程度與其所接受的電子數(shù)呈定量關系。當與抗自由基活性物質(zhì)作用時,其吸收值降低越多,則表明抗自由基活性物質(zhì)的活性越強,具體可由清除率來衡量。圖1為不同加入量的山楂葉總黃酮對DPPH自由基的清除能力。在反應體系中,加入量為0.4~2mg時,隨著加入量的增加,山楂葉總黃酮對DPPH自由基的清除率逐漸增加;加入量不變,清除率隨時間的延長先迅速增加而后趨于平緩。在加入20min時,各加入量對DPPH自由基的清除率均接近最大值。加入量達到2mg時,清除率最大,可達50.29%?？梢?山楂葉總黃酮對DPPH自由基有一定的清除能力。圖2為不同加入量的蘆丁對DPPH自由基的清除能力。在反應體系中,加入量在0.4~2mg時,蘆丁對DPPH自由基的清除率隨加入量及時間的變化趨勢類似于山楂葉總黃酮。加入量2mg時,清除率最高可達63.83%,而且相同加入量時,蘆丁的清除率曲線上相應的值要高于山楂葉總黃酮,說明蘆丁對DPPH自由基的清除能力強于山楂葉總黃酮。圖3為不同加入量的VC對DPPH自由基的清除能力。在反應體系中,加入量在0.08~0.4mg范圍內(nèi)時,VC對DPPH自由基的清除率隨加入量及時間的變化趨勢類似于山楂葉總黃酮和蘆丁。在加入10min時,各加入量對DPPH自由基的清除率均接近最大值。加入量為0.4mg時,清除率最大可達69.93%,可見VC對DPPH自由基的清除能力遠大于蘆丁和山楂葉總黃酮。同時,綜合比較圖1~圖3發(fā)現(xiàn),VC對DPPH自由基的清除速度較快,而山楂葉總黃酮對DPPH自由基的清除速度與蘆丁相當,比VC要慢些。2.2不同物質(zhì)對超氧陰離子自由基的清除率在堿性條件下,鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應,生成超氧自由基和有色中間產(chǎn)物,該有色產(chǎn)物有特征吸收峰。當加入自由基清除劑時,超氧自由基的生成受到抑制,鄰苯三酚自氧化過程受阻,特征吸收峰減弱,具體由清除率表示清除作用的相對大小。表1為各物質(zhì)不同加入量時的反應速率,根據(jù)清除率公式,計算出各物質(zhì)對超氧陰離子自由基的清除率。圖4為不同物質(zhì)對超氧陰離子自由基的清除效果,其中VC對超氧陰離子自由基具有較強的清除作用,隨著其加入量由0.08mg增加至0.32mg時,清除率由34.91%迅速升高至98.58%;加入量為0.4mg時,清除率已接近100%。同樣,蘆丁對超氧陰離子的清除率也隨加入量的增加而升高,但升高的幅度與VC比卻小得多,蘆丁加入量為2mg時,清除率達到32.55%。山楂葉總黃酮加入量在0.4~1.2mg范圍時,清除率隨加入量的增加而增加,加入量為1.2mg時,清除率達到最高為27.36%,此時比蘆丁的清除率高。但山楂葉總黃酮加入量超過1.2mg時,清除率卻有所下降,明顯低于蘆丁。而二者最高清除率也僅接近于0.08mgVC的清除率,足見二者對超氧陰離子自由基的清除能力較VC低很多。3清除超氧陰離子自由基的能力3.1加入量在0.4~2mg范圍時,山楂葉總黃酮對DPPH自由基和超氧陰離子自由基均具有一定的清除作用。山楂葉總黃酮加入量為2mg時,對DPPH自由基的清除率達到最高值50.29%;當加入量為1.2mg時,對超氧陰離子自由基的清除率達到最高值27.36%。山楂葉總黃酮對DPPH自由基的清除作用強于對超氧陰離子自由基的作用。3.2蘆丁的加入量為2mg時,對DP