生物素化單抗-親和素在荷人結(jié)腸癌裸鼠模型中的應(yīng)用

生物素化單抗-親和素在荷人結(jié)腸癌裸鼠模型中的應(yīng)用

環(huán)境預(yù)測技術(shù)始于80年代中期，其應(yīng)用方法主要包括步行系統(tǒng)和步行系統(tǒng)。其中三步法是在生物素化單抗注射后,用親和素(Avidin,Av)作為“追捕物”(Chaser)來清除循環(huán)中腫瘤未結(jié)合單抗,然后再給予核素標(biāo)記生物素及其衍生物。三步法預(yù)定位技術(shù)中的第二步和第三步對所有研究均是通用的,而放射性標(biāo)記生物素及其衍生物既可作為診斷用核素也可作為治療用核素的載體。153Sm系鑭系放射性核素,對放射免疫治療具有極好的物理特性。它系β輻射體[Emax=640keV(30%),710keV(50%)和810keV(20%)],半衰期為1.95d,并且還發(fā)射103keV的γ射線(28%),又適宜于γ顯像。因此是目前令人矚目的治療用核素之一。本工作選用適合國內(nèi)推廣的既發(fā)射γ射線又發(fā)射β射線的核素153Sm,以直接標(biāo)記單抗作為對照,在荷人結(jié)腸癌裸鼠模型上實(shí)現(xiàn)三步法放免預(yù)定位治療的實(shí)驗(yàn)研究。1材料和方法1.1生物和抗劑的制備抗CEA單抗(CEAMcAb)及正常小鼠IgG(mIgG),由上海市免疫學(xué)研究所制備;生物素活化酯(BNSH)、DTPA-生物胞素(DB2)和親和素(Av),Sigma公司產(chǎn)品;鏈霉親和素(Streptavidin,SA),上海市靜安區(qū)醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所提供;153SmCl3,中國原子能科學(xué)研究院產(chǎn)品。1.2標(biāo)記方法和鑒定1.2.1碳酸氫鹽緩沖液sdBNSH/DMSO溶液滴加至McAb或mIgG的碳酸氫鹽緩沖液(CBS)中,室溫放置1h,微量離心柱法純化。間接ELISA法鑒定生物素活性,SDS測定生物素化單抗純度。1.2.2cdtpaa的合成用DTPA環(huán)酐法標(biāo)記單抗,參照Hnatowich等的方法。配制1mg/mL的cDTPAa氯仿懸液于小瓶中,按CEAMcAb/DTPA摩爾比1:20取cDTPAa。用高純度的氮?dú)獯蹈?加200μg的CEAMcAb(用pH8.2的碳酸氫鹽緩沖液配制),混勻后置于室溫下振蕩1min,反應(yīng)15—20min,用乙酸終止反應(yīng)。微量離心柱法純化。1.2.3u3000cea-ceamcab的制備取純化的CEAMcAb-DTPA偶聯(lián)物溶液0.1mL,加入約40MBq的153SmCl3(比活度為22.2GBq/mL),室溫反應(yīng)20min,即得153Sm-DTPA-CEAMcAb偶聯(lián)物。30%三氯乙酸沉淀法測定標(biāo)記率和放化純度,間接ELISA法鑒定標(biāo)記物的免疫活性。1.2.4加入/溶解ml用1mol/L醋酸鈉將DB2配成濃度2mg/mL,加入153Sm,室溫放置30min。薄層層析測定標(biāo)記率和放化純度,以硅膠薄層層析板作為支持物,展開劑為85%甲醇溶液。1.3羅馬不吉模式的既定位置和免費(fèi)治療1.3.1balb/c裸鼠腫瘤治療組自行建立的裸鼠皮下可移植性人結(jié)腸癌模型。將瘤塊組織剪成碎片,加入少許生理鹽水,然后用針筒抽取少許(約0.2mL),注入4—5周齡BALB/C裸鼠前肢皮下,12h傷口愈合,接種腫瘤第3天進(jìn)行治療。1.3.2患者血清內(nèi)注射pesm-db2采用單次較大劑量治療。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組,每組5只。A組為三步預(yù)定位治療組,尾靜脈注射100μgCEAMcAb-Bt,48h后注射80μgAv,24h再經(jīng)腹腔內(nèi)注射11.1MBq/100μL153Sm-DB2。B、C、D三組為治療對照組,B組腹腔內(nèi)注射153Sm-CEAMcAb11.1MBq/100μL,C組腹腔內(nèi)注射153Sm-mIgG11.1MBq/100μL,D組腹腔內(nèi)注射153Sm-DB211.1MBq/100μL。E組為非治療對照組,腹腔內(nèi)注射生理鹽水100μL。1.4腫瘤抑制作用的觀察1.4.1腫瘤體積、抑制率計算采用雙盲法,在治療前后每周定時測量腫瘤的最長徑(a)和最短徑(b),按照V=1/6πab2的公式計算腫瘤體積(cm3)。并按下列公式計算腫瘤抑制率(IR)。IR%=[(非治療對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/非治療對照組腫瘤體積]×100%1.4.2組織病理學(xué)的檢測治療5周后處死實(shí)驗(yàn)裸鼠,分離腫瘤及裸鼠正常器官組織,稱重后用10%福爾馬林溶液固定,作常規(guī)病理檢查。1.5中毒的觀察1.5.1定期測量裸鼠的體重以末體重/初體重(FBW/IBW)作評價,當(dāng)FBW/IBW>0.80判斷無毒性,FBW/IBW<0.80判斷有毒性。1.5.2觀察前后白細(xì)胞計數(shù)的變化治療前后每周常規(guī)取血作白細(xì)胞計數(shù),判斷輻射對宿主造血功能的影響。1.6統(tǒng)計分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)處理。2結(jié)果2.1bq/mol的免疫活性153Sm-CEAMcAb比活度為15.54GBq/mol,放化純度>95%,標(biāo)記單抗的免疫活性50%左右。153Sm-DB2比活度為37GBq/mmol,與SA結(jié)合后放化純度>95%。2.2各組腫瘤的生長抑制2.2.1兩組腫瘤生長比較從表1可見,治療第1周內(nèi),各組腫瘤體積無明顯差異。治療第2周后,預(yù)定位治療組和標(biāo)記單抗治療組腫瘤生長開始減慢;第5周時的腫瘤體積明顯小于非治療對照組(P<0.001)。此時153Sm-mIgG治療對照組和153Sm-DB2治療對照組也小于非治療對照組(P<0.01)。2.2.2兩組患者對腫瘤的抑制率從表2可見,預(yù)定位治療組和標(biāo)記單抗治療組對腫瘤的生長有明顯抑制作用,治療后第5周腫瘤平均抑制率分別為80.67%和78.44%,而153Sm-mIgG和153Sm-DB2治療對照組對腫瘤的抑制率分別為29.78%和23.99%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,前兩組與后兩組差異有非常顯著性(P<0.01)。2.2.3大鼠腫瘤組織病理學(xué)檢查從圖1—3可見,取接受153Sm-CEAMcAb及三步預(yù)定位治療后裸鼠的腫瘤組織,其組織病理學(xué)檢查可見腫瘤組織呈壞死樣改變,而正常臟器如肝、腎等未見損傷。2.3標(biāo)記劑的毒性評價2.3.1血白領(lǐng)計數(shù)結(jié)果治療前后每周檢測外周血白細(xì)胞數(shù),與非治療對照組比較,153Sm各治療組在治療后2周內(nèi)血白細(xì)胞總數(shù)均有不同程度的下降,并在第5周后漸恢復(fù)正常,其中尤以153Sm-mIgG治療對照組和標(biāo)記單抗治療組血白細(xì)胞總數(shù)降低更甚,且恢復(fù)正常所需的時間更長。提示在該輻射劑量下對宿主的造血功能有抑制作用。2.3.2裸鼠體重測量預(yù)定位治療組及治療對照組在治療期間FBW/IBW均大于0.80,說明所采用的劑量無毒性反應(yīng)。3是否存在固定依托于腫瘤治療的rait腫瘤放射免疫治療(RIT)臨床應(yīng)用的最大障礙是腫瘤與標(biāo)記抗體的結(jié)合率(%ID/g)低。藥代動力學(xué)研究還表明,標(biāo)記抗體在腫瘤內(nèi)定位和從正常組織臟器(本底)清除相對緩慢,需要24—48h才能在腫瘤部位達(dá)到最大聚集,此時血循環(huán)中的抗體尚未完全清除,故RIT對放射性敏感的骨髓具有劑量依賴性毒性作用,使治療時投入的有效劑量受到限制。因此,提高腫瘤導(dǎo)向治療效果的措施之一,是尋找能夠降低周圍血本底、提高腫瘤T/NT比值的方法,以減輕對周圍造血系統(tǒng)的抑制,提高療效。而親和素-生物素系統(tǒng)(ABS)預(yù)定位技術(shù)的原理是將抗體和放射性核素分開給藥,延長抗體在腫瘤細(xì)胞上的滯留時間,使腫瘤結(jié)合抗體與未結(jié)合抗體之比達(dá)最大值。目前該項技術(shù)已在臨床上用于多種類型腫瘤的RII診斷,而且擴(kuò)大到RIT,并取得了一定成效。本實(shí)驗(yàn)選用診治兼用的放射性核素153Sm,利用153Sm標(biāo)記生物素的三步法預(yù)定位對裸鼠載人結(jié)腸癌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性預(yù)定位放免治療,治療實(shí)施的時間選擇在接種腫瘤的第3天,以直接標(biāo)記單抗作為對照,結(jié)果顯示,三步法預(yù)定位治療與直接標(biāo)記單抗同樣具有腫瘤抑制作用,應(yīng)用11.1MBq/鼠觀察到腫瘤處于明顯受抑狀態(tài),治療第5周腫瘤的抑制率分別達(dá)到80.67%和78.44%。這提示三步法預(yù)定位RIT具有較好的選擇性,原因可能與早期腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少,腫瘤抗原的異質(zhì)性還不明顯,對放射性比較敏感等。此外,153Sm-mIgG和153Sm-DB2也具有一定的殺腫瘤效應(yīng),治療第5周其腫瘤抑制率分別為29.78%和23.99%,這可能系非特異性殺傷作用。采用單次較大劑量投入治療,預(yù)定位治療在產(chǎn)生抑瘤效應(yīng)的同時未產(chǎn)生明顯的毒副作用,裸鼠體重及外周血白細(xì)胞計數(shù)未見明顯下降;而153Sm-CEAMcAb和153Sm-mIgG則觀察到外周血白細(xì)胞計數(shù)下降。這是因?yàn)镃EAMcAb和mIgG的153Sm標(biāo)記物自腹腔注入后首先入血,循環(huán)中的153Sm標(biāo)記物不能立即與瘤細(xì)胞結(jié)合,不但其免疫活性和放射性活度會隨著時間的推移而較快降低,而且對非腫瘤組織的照射必然較強(qiáng)。而預(yù)定位技術(shù)則因不需要采用153Sm標(biāo)記抗體,避免了抗體的免疫活性的