一例羊傳染性膿皰病毒分子特征分析

一例羊傳染性膿皰病毒分子特征分析

綿羊感染（通常稱為羊口傷口）是由痘病毒科引起的。副痘病毒是由羊感染膿毒者引起的人類感染。該病主要危害3~6月齡羔羊和部分成年羊,羔羊發(fā)病率可高達(dá)100%,臨床癥狀表現(xiàn)為嘴唇、口黏膜部分皮膚紅疹、膿皰、潰瘍和結(jié)痂;羔羊表現(xiàn)為齒唇部破潰,不能吃奶,若繼發(fā)或混合感染其他病原微生物死亡率較高。該病世界范圍內(nèi)發(fā)生,且廣泛流行,近年來隨著肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和羊頻繁流動,該病時有發(fā)生,給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。羊口瘡在我國部分地區(qū)暴發(fā)和流行,嚴(yán)重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。如2005年3月廣西馬山縣、2005年4月山西省保德縣、2005年9月甘肅省山丹縣,2006年7月吉林省松原市,北京市和江蘇省淮安市曾報道有該病的發(fā)生。更為嚴(yán)重的是此病可以通過傷口感染飼養(yǎng)人員,表現(xiàn)為手背、指間和前臂部皰疹和破潰。例如2005年8月福建省永安市有8名羊場養(yǎng)殖工人因感染羊傳染性膿皰病毒而發(fā)病。因此,羊傳染性膿皰不但嚴(yán)重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展,而且威脅人類的身體健康,是一種危害較為嚴(yán)重的人畜共患傳染病。單獨依靠臨床癥狀進(jìn)行該病的診斷具有一定的不準(zhǔn)確性,病毒分離鑒定雖然是診斷羊傳染性膿皰的金標(biāo)準(zhǔn),但是因耗時長而制約了臨床應(yīng)用,電鏡觀察和PCR技術(shù)具有速度快、靈敏度高等特性而被廣泛應(yīng)用。ORFVB2L基因作為主要免疫原性基因常被用來進(jìn)行病毒的鑒定和遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。作者對2009年發(fā)生于湖北地區(qū)某羊場疑似羊口瘡病料進(jìn)行了病毒電鏡觀察,病理切片染色、特異性基因(B2L)擴(kuò)增以及基于B2L基因序列的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。1材料和方法1.1復(fù)配采集自2009年湖北某羊場疑似羊口瘡黑山羊的唇部痂皮,加無菌PBS(pH7.2)和適量滅菌石英砂研磨制成1∶10懸液,反復(fù)凍融3次后5000r·min-1離心30min取上清。上清中加入3%氯化鈉(質(zhì)量比)和15%PEG(體積比)4℃攪拌過夜后,12000r·min-1離心30min,沉淀用1/10體積(離心前體積)PBS溶解。1.2病理切開物和散列取適當(dāng)大小的痂皮塊按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟切片、HE染色和顯微鏡觀察。1.3病毒粒徑形態(tài)觀察取適量1.1中最后溶解上清懸液滴加到覆蓋有Formvar膜的銅網(wǎng)上,吸附5min后用濾紙將銅網(wǎng)上的病毒懸液吸去,待Formvar膜干燥后滴加20g·L-1磷鎢酸染色1min,然后用濾紙將磷鎢酸吸去,待銅網(wǎng)干燥后用P62-JSM-6390LV型號電子顯微鏡觀察病毒粒子形態(tài)。1.4引物的篩選根據(jù)GenBank公布的參考序列(GQ328006)設(shè)計羊ORFVB2L基因特異性擴(kuò)增引物,上游引物為5′-AAAGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCAT-3′,下游引物為5′-AAACTCGAGTTAATTTATTGGCTTGCAGA-3′。為便于該基因后續(xù)表達(dá),上游引物引入BamHⅠ酶切位點(下劃線部分),下游引物引入XhoⅠ酶切位點(下劃線部分)。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。1.5pcr擴(kuò)增取1.1中沉淀后溶解上清500μL,按DNA快速提取試劑盒方法提取總DNA,取5μL作為模板,反應(yīng)體系為EXDNApolymerase(5U·μL-1)0.25μL,10×buffer5μL,dNTPmixture(各2.5mmol·L-1)4μL,上游引物20μmol·L-11μL,下游引物20μmol·L-11μL,滅菌蒸餾水33.75μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,56.5℃退火1min,72℃延伸1.5min,35個循環(huán);72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后,取反應(yīng)液5~10μL,0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.6質(zhì)粒提取和鑒定目的基因經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收后和T-Vector連接,連接體系為T4DNAligase1μL,T4DNAligationbuffer3μL,目的基因5μL,T載體1μL,16℃過夜連接;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌,涂Amp抗性平皿后提取質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR鑒定命名為T-B2L。將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行序列測定,并提交GenBank。收集GenBank公布的其他毒株B2L基因序列(詳細(xì)信息略),使用DNAStar、Mega4.0軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析和遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。2結(jié)果2.1電鏡觀察處理病料,經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后在電鏡下觀察可見直徑150~200nm、卵圓形、有囊膜的病毒顆粒(圖1)。2.2病理人類學(xué)制備病理切片,進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察可見表皮層腫脹,組織間有大量炎性細(xì)胞浸潤(圖2)。2.3基因擴(kuò)增PCR擴(kuò)增結(jié)束后,取產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下可見預(yù)期約1100bp目的片段(圖3)。2.4dnast-pcr檢測回復(fù)突變型的分析序列測定結(jié)果顯示B2L基因全長1137bp,編碼379個氨基酸,GC含量為64.03%,將該基因序列提交GenBank,獲得序列號為GU320351。將該序列和已經(jīng)公布的B2L基因序列(詳細(xì)信息略),使用DNAStar和Mega4.0軟件進(jìn)行分析,結(jié)果表明本研究鑒定的ORFV和DQ904351同源性最高,與印度2004到2005年分離于綿羊(DQ263306、DQ263305)、山羊(DQ263304、DQ263303)ORFV同屬一個進(jìn)化分支(圖4);氨基酸序列同源性分析表明該毒株和其他病毒株(17株)同源性為97.1%~99.7%。3遺傳進(jìn)化關(guān)系羊口瘡嚴(yán)重威脅肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和人類身體健康,受到越來越多人的重視,因此該病的綜合防控已經(jīng)被提上日程。快速的病原鑒定是有效防控羊口瘡的前提和基礎(chǔ),及時的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析為進(jìn)一步研制“與時俱進(jìn)”的疫苗和診斷試劑提供科學(xué)依據(jù)。B2L基因作為ORFV外膜蛋白基因,編碼大小約為42ku的免疫原性蛋白,ORFV病原分子生物學(xué)診斷大部分是采用B2L基因為對象的PCR方法。盡管我國有很多關(guān)于羊口瘡的病例診斷及治療報道,但是至今很少公布該病毒的基因序列,較少研究該病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系。為確診該山羊疑似口瘡病例進(jìn)行了ORFV病原檢測,即從疑似病料中觀察到痘病毒粒子(圖1),擴(kuò)增到ORFV特異性B2L基因(圖3),序列測定表明為ORFV基因組序列的一部分,因此結(jié)合病羊臨床癥狀將疑似病例確診為山羊口瘡。為明確該病毒分子特征,本試驗將該ORFVB2L基因序列和世界范圍內(nèi)已公布的17株病毒序列進(jìn)行了比較分析,建立了遺傳進(jìn)化關(guān)系樹。結(jié)果表明本試驗鑒定株TS/HuB/CHIA/2009和世界范圍內(nèi)其他ORFV毒株(17株)B2L基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性為97.1%~99.7%;與中國臺灣2007年分離株(DQ904351)遺傳關(guān)系最近,與2004和2005年分離于印度綿羊和山羊的ORFV同屬一個進(jìn)化分支(圖4),這一結(jié)果和我國肉羊引種及國內(nèi)羊