不同類型卵巢對(duì)大鼠腎上腺皮質(zhì)bcl-2和bax表達(dá)的影響

不同類型卵巢對(duì)大鼠腎上腺皮質(zhì)bcl-2和bax表達(dá)的影響

隨著年齡的到來(lái)，女性卵巢功能的降低導(dǎo)致卵巢酶原的分泌減少，從而影響全身系統(tǒng)的功能，同時(shí)導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能的變化。劉慧娟等研究發(fā)現(xiàn),切除大鼠雙側(cè)卵巢可引起腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶代償性增厚,細(xì)胞增生,分泌功能增強(qiáng)。Dong等發(fā)現(xiàn),Bcl-2在其基因增強(qiáng)子區(qū)有雌激素反應(yīng)元件(ERES)序列,雌激素可促進(jìn)Bcl-2的表達(dá),而抑制細(xì)胞的凋亡。有關(guān)雌激素促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)的研究報(bào)道較多,但大多集中在腦缺血區(qū)、子宮內(nèi)膜、心內(nèi)神經(jīng)節(jié)等區(qū),尚未見到有關(guān)腎上腺中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的報(bào)道。為了探討雌激素對(duì)腎上腺皮質(zhì)的作用機(jī)制,本文進(jìn)行了雌激素對(duì)腎上腺皮質(zhì)各層中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)影響的研究。1免疫組化染色健康雌性SD大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)共30只,3月齡,體重210～240g。隨機(jī)分為3組:第一組假手術(shù)組(C組);第二組卵巢摘除組(OVX組);第三組卵巢摘除并用17β-雌二醇(E2)治療組(OVX+E2組)。每組各10只,采用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,C組做假手術(shù),OVX和OVX+E2組摘除雙側(cè)卵巢,手術(shù)1周后,OVX+E2組,隔天皮下注射17β-雌二醇10μg/只(Sigma公司產(chǎn)品,溶于無(wú)水乙醇,注射劑量參照Suresh等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果),C組和OVX組皮下注射等量無(wú)水乙醇,連續(xù)4周。末次注射17β-雌二醇后24h,各組大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉,經(jīng)主動(dòng)脈灌注固定,取腎上腺,于相同的固定液中后固定4～8h,浸入4℃20%蔗糖PB液(pH=7.4)中,直至組織沉淀,將組織于開放式冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片,切片厚35μm。免疫組化染色程序按照SP試劑盒(福州邁新生物公司產(chǎn)品)說(shuō)明進(jìn)行,第一抗體(武漢博士德公司產(chǎn)品)Bcl-2、Bax多克隆抗體工作濃度分別為1∶150和1∶200。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組,用0.01mol/LPBS代替第一抗體,其余步驟相同。硫酸鎳胺增強(qiáng)的DAB藍(lán)色體系呈色,貼片,晾干,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。陽(yáng)性產(chǎn)物呈深藍(lán)色或藍(lán)色,陰性對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性產(chǎn)物。每組免疫組化染色切片隨機(jī)選取5個(gè)不同部位,Motic數(shù)碼顯微鏡拍照,江蘇捷達(dá)801形態(tài)分析軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析,測(cè)量陽(yáng)性產(chǎn)物灰度值,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Xˉˉˉ±S)(Xˉ±S)表示,t-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1ovx對(duì)bcl-2表達(dá)的影響對(duì)各組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶Bcl-2和Bax表達(dá)陽(yáng)性產(chǎn)物灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果如表1所示。C組中,Bcl-2和Bax表達(dá)較少,染色較淺,Bcl-2在細(xì)胞束間的毛細(xì)血管內(nèi)皮有少量表達(dá)(圖版Ⅰ:1);OVX組中Bcl-2表達(dá)增多,但差異無(wú)顯著性;Bax表達(dá)較C組顯著增加(P<0.05),染色深,在細(xì)胞束間的毛細(xì)血管內(nèi)皮分布有深染的陽(yáng)性產(chǎn)物(圖版Ⅰ:2);在補(bǔ)充外源性雌二醇之后Bcl-2表達(dá)顯著減少(P<0.05)(圖版Ⅰ:3),Bax表達(dá)極顯著減少(P<0.01)。2.2不同外源性男性二醇a型的染色表達(dá)對(duì)各組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶Bcl-2和Bax表達(dá)陽(yáng)性產(chǎn)物灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果如表2所示。C組中Bcl-2和Bax都有多量分布,染色都較束狀帶深;OVX組中兩者表達(dá)都顯著增加(P<0.05),染色深(圖版Ⅰ:4,5);補(bǔ)充外源性雌二醇后,Bcl-2表達(dá)極顯著減少(P<0.01),Bax無(wú)陽(yáng)性產(chǎn)物。在球狀帶,C組中Bcl-2和Bax都弱陽(yáng)性表達(dá)(圖版Ⅰ:6)。OVX組中Bax強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),而Bcl-2沒有陽(yáng)性產(chǎn)物;補(bǔ)充雌二醇后Bcl-2和Bax都弱陽(yáng)性表達(dá),基本恢復(fù)正常水平。3激素對(duì)臟器調(diào)節(jié)作用的影響大量研究表明,性腺對(duì)腎上腺功能發(fā)揮有重要的意義。EnzioMullerR等人研究發(fā)現(xiàn),在雄性大鼠,去勢(shì)引起腎上腺束狀帶和網(wǎng)狀帶細(xì)胞增生。吳波等發(fā)現(xiàn),在雌性大鼠,切除雙側(cè)卵巢使腎上腺萎縮。最新研究發(fā)現(xiàn),去卵巢使大鼠腎上腺皮質(zhì)總厚度和束狀帶厚度均呈萎縮性變化,束狀帶細(xì)胞交叉成網(wǎng),失去平行排列及與被膜垂直的結(jié)構(gòu)特征,而腎上腺網(wǎng)狀帶細(xì)胞代償性肥大,網(wǎng)狀帶增厚。伴隨這些解剖學(xué)變化,腎上腺發(fā)生功能變化。Bcl-2和Bax是與凋亡密切相關(guān)的蛋白質(zhì),其作用是相互拮抗的,他們通過(guò)蛋白-蛋白的相互結(jié)合與解聚作用主宰著細(xì)胞的存活與凋亡。當(dāng)Bcl-2大量表達(dá)時(shí),形成Bcl-2同源二聚體,細(xì)胞受到保護(hù);當(dāng)Bax大量表達(dá)時(shí),形成Bax同源二聚體,細(xì)胞趨向凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雌激素在腎上腺皮質(zhì)各層發(fā)揮著不同作用。在束狀帶摘除卵巢后Bax表達(dá)顯著增加,而Bcl-2的變化無(wú)顯著性差異。Bax作為一種促凋亡蛋白,其表達(dá)增多說(shuō)明細(xì)胞趨向凋亡。推測(cè)雌激素通過(guò)下調(diào)Bax表達(dá)從而保護(hù)束狀帶細(xì)胞,影響其分泌功能。網(wǎng)狀帶細(xì)胞主要分泌雄激素,同時(shí)分泌少量的雌激素。在此區(qū),雌激素對(duì)Bcl-2和Bax都具有下調(diào)作用,而且對(duì)其下調(diào)作用均無(wú)顯著性差異。細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性主要決定于Bcl-2和Bax之間的比例。表明了雌激素能維持網(wǎng)狀帶細(xì)胞Bcl-2和Bax之間的相對(duì)平衡,從而維持網(wǎng)狀帶細(xì)胞功能的發(fā)揮。而在球狀帶,雌激素通過(guò)下調(diào)Bax表達(dá)的同時(shí)上調(diào)Bcl-2表達(dá),從而保護(hù)球狀帶細(xì)胞免受凋亡。假手術(shù)組中,束狀帶細(xì)胞束間毛細(xì)血管內(nèi)皮有Bcl-2表達(dá),說(shuō)明Bcl-2是維持此區(qū)血液供應(yīng)所必需。摘除卵巢后,Bax在