硒對aom誘導(dǎo)結(jié)腸癌大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞組織化學(xué)的影響

硒對aom誘導(dǎo)結(jié)腸癌大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞組織化學(xué)的影響

氧化偶氮甲烷（ao）是一種致癌性疾病。它通過細(xì)胞膜和dna的氧化，導(dǎo)致腸道粘膜細(xì)胞的過度增殖。通常用于建立嚙齒類動物結(jié)腸癌模型,光鏡下觀察甲基藍(lán)染色結(jié)腸黏膜,出現(xiàn)異常隱窩灶(aberrantcryptfoci,ACF)及異常隱窩(aberrantcrypt,AC)即說明建模成功。硒是人體所必需的微量元素,同時也是一種廣泛的抗癌因子。早在1949年,Clayton和Baumann首次報道用含5μg/g硒(亞硒酸鈉)/飼料喂養(yǎng)大鼠,可防止二甲基氨基苯對大鼠的致結(jié)腸癌作用,為硒與結(jié)腸腫瘤的關(guān)系提供了最早的依據(jù)。很多學(xué)者做了大量體內(nèi)及體外實驗來探討硒在腫瘤中的作用及可能機(jī)制,我們以往的研究證實硒抗大鼠胃癌與機(jī)體內(nèi)分泌變化密切相關(guān),同時硒調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的研究日益得到關(guān)注,但在癌發(fā)生、發(fā)展的過程中,機(jī)體自身內(nèi)分泌的變化以及硒抗腫瘤是否通過自身內(nèi)分泌激素的介導(dǎo)而發(fā)揮作用,人們?nèi)灾跎佟１緦嶒灁M觀察分析AOM誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸癌產(chǎn)生對其腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞組織化學(xué)的變化,以及微量元素硒對該模型中腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞組織化學(xué)的影響,有關(guān)該方面的研究目前國內(nèi)外尚未見報道。材料和方法1.不同濃度的鹽水配制AOM(美國田納西大學(xué)Williams教授饋贈,Sigma):生理鹽水配制,終濃度為1.25g/L。亞硒酸鈉(Na2SeO3,北京化工廠產(chǎn)品),蒸餾水配制,使用濃度為4mg/L。2.實驗大鼠的分組和治療3周齡斷乳SpragueDawley(SD)雄性大鼠20只,體重45-50g/只,購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部。將大鼠隨機(jī)分為4組:即,正常對照組(n=5,喂常規(guī)飼料和自來水,不給AOM和硒水);實驗對照組(n=5,于第5、6周腹腔注射AOM,15mg/kg體重,不給硒水);致癌劑前補(bǔ)硒組(n=5,第3周起喂?jié)舛?mg/L的硒水,第5、6周腹腔注射AOM,15mg/kg);致癌劑后補(bǔ)硒組(n=5,第5、6周腹腔注射AOM,15mg/kg,第7周起喂?jié)舛?mg/L的硒水)。3.肝腎組織切片于實驗第34周,10%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠(2ml/kg體重)后取材,取結(jié)腸和雙側(cè)腎上腺。一側(cè)腎上腺用Bouin液固定,浸蠟包埋,5μm的石蠟切片備用;另一側(cè)用OCT包裹,迅速投入液氮,后置-80℃冰箱中保存,待用。4.大鼠結(jié)腸模型的建立大鼠整段結(jié)腸用10%中性福爾馬林液固定后,用0.2%亞甲基藍(lán)分段對大鼠結(jié)腸黏膜進(jìn)行染色,解剖顯微鏡下計數(shù)ACF及AC,以確定大鼠結(jié)腸癌模型建立成功。5.腎上腺he染色腎上腺石蠟切片脫蠟入水,常規(guī)HE染色。中性樹膠封片。6.最優(yōu)染色取出備用的-80℃冰凍的腎上腺組織,恒冷箱(-15℃--20℃)切片,厚為6μm。進(jìn)行蘇丹黑B法和油紅O法脂類染色;用四唑鹽法(tetrazoliumsalt氯化硝基藍(lán)四唑)進(jìn)行琥珀酸脫氫酶(SDH)的組織化學(xué)染色;硝基藍(lán)四唑(NBT)顯示3β-羥類固醇脫氫酶(3β-HSD),均甘油明膠封片。7.平均光密度測定用MoticImagesAdvanced圖像分析系統(tǒng),對腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞的脂類、SDH、3β-HSD組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行分析。每一標(biāo)本隨機(jī)取5張組織切片,每片間隔30μm,選擇切片空白區(qū)進(jìn)行陰影校正之后,測定空白區(qū)灰度值,每個標(biāo)本在其束狀帶區(qū)域按順時針方向取5個視野,測定其陽性反應(yīng)產(chǎn)物的灰度值,被測灰度換算成平均光密度(meanopticdensity,MOD)值,MOD值=lg空白灰度值/被測視野灰度值。SPSS軟件對組間均數(shù)進(jìn)行方差分析。結(jié)果1.巖肉細(xì)胞間的he染色光鏡下,亞甲基藍(lán)染色大鼠結(jié)腸AC較正常隱窩深染,呈深藍(lán)色,體積增大。ACF明顯突出黏膜表面,隱窩上皮細(xì)胞增高;HE染色,低倍下見結(jié)腸隱窩間結(jié)締組織內(nèi)布滿各種形態(tài)的細(xì)胞,毛細(xì)血管豐富。高倍下,隱窩上皮細(xì)胞極性消失,多不規(guī)則排列成多層,細(xì)胞大小不一,核大而深染,核-質(zhì)比例增大,細(xì)胞核分裂增多,可見腺管共壁背靠背和篩樣結(jié)構(gòu),呈重度非典型性增生。腺腔內(nèi)多見脫落壞死的瘤細(xì)胞、浸潤的炎性細(xì)胞及分泌的嗜酸性的團(tuán)狀物質(zhì)(圖1)。2.土壤有法律上的組織學(xué)特性各組樣本常規(guī)HE染色,光鏡下組織學(xué)觀察結(jié)果基本一致。腎上腺皮質(zhì)占腺體大部分,被膜結(jié)締組織伸入到實質(zhì)中形成網(wǎng)狀的結(jié)締組織支架,皮質(zhì)由外向內(nèi)由球狀帶、束狀帶和網(wǎng)狀帶組成。束狀帶最厚,細(xì)胞排列成柱狀束,細(xì)胞質(zhì)呈泡沫狀。皮質(zhì)各帶細(xì)胞團(tuán)束之間有血竇(圖2)。3.束狀帶內(nèi)酯類物質(zhì)油紅O法顯示細(xì)胞內(nèi)脂類小滴呈桔紅色,蘇丹黑B法為黑(墨藍(lán)色)色。光鏡下觀察,二種方法染色脂類小滴,各組束狀帶內(nèi)脂類小滴較多(圖3,4);SDH和3β-HSD活性部位陽性反應(yīng)產(chǎn)物均為細(xì)小的藍(lán)紫色甲顆粒,顆粒的多少和顏色的深淺反應(yīng)酶的活性大小,二酶活性在束狀帶和網(wǎng)狀帶細(xì)胞內(nèi)較強(qiáng),球狀帶細(xì)胞內(nèi)較弱(圖5,6)。4.致病性大鼠肝腎皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞的sc圖像分析結(jié)果數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,見附表。與正常對照組相比,實驗對照組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞的SDH和3β-HSD的MOD值明顯增加(P<0.05),脂類的MOD值明顯減少(P<0.05);與實驗對照組相比,致癌劑前/后補(bǔ)硒組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞的SDH和3β-HSD的MOD值均有增加,脂類的MOD值減少,其中致癌劑后補(bǔ)硒組SDH和3β-HSD的MOD值增加有統(tǒng)計意義(P<0.05);致癌劑前/后補(bǔ)硒組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞的脂類、SDH和3β-HSD的MOD值均無明顯差異(P>0.05)。肝腎皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞活性及功能的變化機(jī)體是一個統(tǒng)一整體,當(dāng)其穩(wěn)態(tài)被各種因素(如腫瘤)打破時,其中的某些部分會做出反應(yīng)和功能上的改變,這體現(xiàn)了機(jī)體的自然抗病過程。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)密切相關(guān),而垂體-腎上腺軸是機(jī)體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。本實驗觀察了AOM誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸癌產(chǎn)生對腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞的變化,以及微量元素硒對AOM誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌形成模型中腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞的影響,目前國、內(nèi)外尚未見報道。AOM是一種結(jié)腸癌致癌劑,通常用來誘導(dǎo)嚙齒類動物產(chǎn)生結(jié)腸癌,此為一成熟的動物模型。本實驗于第34周通過大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)變化的觀察,即大鼠結(jié)腸黏膜AC及ACF的出現(xiàn),證實了該動物模型構(gòu)建的成功。腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞富含膽固醇,是合成類固醇激素的重要原料。在不同實驗條件下,腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞脂類小滴的含量有變化。Rhodin通過電鏡觀察,認(rèn)為脂類小滴的減少與腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞類固醇激素的釋放有關(guān)。由于腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞中大部分的膽固醇存在于脂類小滴中,脂類的減少,是由于在類固醇激素的合成中加速利用膽固醇引起的。3β-HSD酶是類固醇激素合成過程中孕烯醇酮轉(zhuǎn)變?yōu)樵型@一中間體的關(guān)鍵酶之一,它的活性可以直接反映腎上腺合成類固醇激素的功能狀態(tài)。腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞的SDH酶位于線粒體內(nèi),參與合成ATP,與細(xì)胞的供能有關(guān)。本研究結(jié)果顯示實驗對照組與正常組比較,脂類減少、3β-HSD和SDH酶活性增強(qiáng),提示腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞合成功能增強(qiáng)。Clayton和Baumann于1949年首次報道用含硒飼料喂養(yǎng)大鼠,可防止二甲基氨基苯對大鼠的致結(jié)腸癌作用,為硒與腫瘤的關(guān)系提供了最早的依據(jù)。大量的流行病學(xué)調(diào)查、臨床試驗及實驗室研究,發(fā)現(xiàn)硒可抑制多種腫瘤(乳腺癌、肝癌、肺癌、大腸癌及皮膚癌等)的發(fā)生,并對其抗癌機(jī)制作了大量的研究。有關(guān)硒抗腫瘤作用機(jī)理十分復(fù)雜,相關(guān)的研究報道較多,但總的來說,其防治癌的機(jī)理仍不十分清楚。目前比較肯定的機(jī)制主要有①硒可抑制因物理或化學(xué)因素誘發(fā)的氧化損傷;②抑制腫瘤細(xì)胞的物質(zhì)合成與能量代謝;③調(diào)控癌基因和抑癌基因的表達(dá);④硒可抑制腫瘤血管生成;⑤對DNA甲基化的影響;⑥硒可增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng),包括細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫。⑦硒對有活性的化合物(如MNNG、MNV等)誘發(fā)的細(xì)胞遺傳突變性有抑制作用。我們以往的研究證實硒抗大鼠胃癌與機(jī)體內(nèi)分泌變化密切相關(guān),但硒抗腫瘤與機(jī)體自身內(nèi)分泌的變化的關(guān)系我們?nèi)圆皇智宄１窘M實驗研究結(jié)果顯示,硒干預(yù)可使腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞的功能得以進(jìn)一步增強(qiáng)。在AOM致大鼠結(jié)腸癌形成過程中,機(jī)體應(yīng)激和機(jī)體激活的免疫細(xì)胞產(chǎn)生許多細(xì)胞因子可激活HPA軸