逍遙散對(duì)慢性約束應(yīng)激致焦慮大鼠的調(diào)節(jié)作用

逍遙散對(duì)慢性約束應(yīng)激致焦慮大鼠的調(diào)節(jié)作用

近年來(lái)，隨著社會(huì)的變遷，核電站的精神衛(wèi)生逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。焦慮和抑郁占很大比例。流行病學(xué)研究顯示,在美國(guó),焦慮癥的終生患病率為5%,而在國(guó)內(nèi)也達(dá)到1.2%。如何建立適合的動(dòng)物模型,成為實(shí)驗(yàn)研究首要解決的問(wèn)題。有研究表明,造成動(dòng)物慢性應(yīng)激抑郁的方法有多種,包括:孤養(yǎng)、隔離、強(qiáng)迫游泳、睡眠剝奪等。目前國(guó)際公認(rèn)的慢性應(yīng)激抑郁模型造模方法是21d慢性不可預(yù)知刺激,以及本課題組多年來(lái)一直沿用的21d慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛動(dòng)物模型,兩者形式雖略有不同,但實(shí)質(zhì)相同,互為補(bǔ)充。然而,對(duì)于如何建立慢性應(yīng)激焦慮動(dòng)物模型一直眾說(shuō)紛紜,尚未達(dá)成統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。本課題組通過(guò)比較大鼠7d、14d以及21d行為學(xué)表現(xiàn),發(fā)現(xiàn)14d慢性應(yīng)激大鼠主要表現(xiàn)為焦慮狀態(tài),而21d大鼠則主要以抑郁為主,這一造模方法在相關(guān)國(guó)外文獻(xiàn)中也有提及。焦慮屬中醫(yī)之“郁證”“不寐”“百合病”等范疇,病因多為情志內(nèi)傷,病位多責(zé)之于心、肝、脾,其中,又以肝為調(diào)節(jié)中樞。肝喜條達(dá),肝失疏泄則肝郁氣滯,橫逆犯脾,脾失健運(yùn)則運(yùn)化無(wú)力,大便溏泄;肝藏血,肝郁暗耗陰血,加之脾虛生化不足,易致血虛。該病病機(jī)多為肝郁脾虛,兼有血虛。本研究通過(guò)相關(guān)大鼠行為學(xué)觀察,結(jié)合既往文獻(xiàn)報(bào)道,進(jìn)一步評(píng)價(jià)14d慢性束縛應(yīng)激焦慮模型以及逍遙散的調(diào)節(jié)作用。清潔級(jí)健康雄性SD大鼠38只,體質(zhì)量為180-200g,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001,由維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,排除過(guò)于活潑或抑郁的,將剩余的36只大鼠隨機(jī)分為4組,分別為正常組、模型組、逍遙散組和氟西汀組,每組9只。喂常規(guī)大鼠飼料及飲用水,室溫(22±2)℃,相對(duì)濕度30%-40%,光線12h白天/12h黑夜。實(shí)驗(yàn)使用中藥復(fù)方選用《太平惠民和劑局方》中的逍遙散,即:北柴胡30g,當(dāng)歸30g,炒白術(shù)30g,茯苓30g,白芍30g,薄荷10g,炙甘草15g,干姜10g,藥物均購(gòu)自北京同仁堂(亳州)飲片有限責(zé)任公司,在中日友好醫(yī)院中藥制劑室煎煮,濃縮成藥粉,每1g藥粉含生藥量為3.18g,灌胃前用去離子水溶解。鹽酸氟西汀膠囊,廠家:PatheonFance,規(guī)格:20mg/粒,批號(hào):2061A。3.大鼠的考核標(biāo)準(zhǔn)除正常組大鼠外,其余3組大鼠均束縛于特制的大鼠束縛架上,每日上午束縛1次,每次3h,連續(xù)14d。正常組、模型組大鼠給予等量的去離子水灌胃,每日1次;逍遙散組大鼠則依據(jù)人與大鼠藥物用量換算公式,換算成0.61g干粉/100g大鼠/d;氟西汀組大鼠藥物用量換算為0.2mg/100g大鼠/d。4.材料和實(shí)驗(yàn)方法每日觀察大鼠的毛發(fā)色澤、身體姿態(tài)、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、耳廓色澤,對(duì)束縛應(yīng)激的反抗情況,以及糞便等。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前測(cè)量1次大鼠體質(zhì)量,依據(jù)大鼠體質(zhì)量情況隨機(jī)進(jìn)行分組,此后每周測(cè)量大鼠體質(zhì)量1次,觀察大鼠體質(zhì)量變化。在糖水實(shí)驗(yàn)前,先對(duì)動(dòng)物進(jìn)行糖水訓(xùn)練,第1天各籠大鼠均給予2瓶1%的糖水,第2天將其中的1瓶糖水換成去離子水,第3天各組大鼠禁食禁水24h,之后準(zhǔn)備100mL去離子水和1%的蔗糖水100mL各1瓶,將每只大鼠單籠喂養(yǎng),測(cè)量1h的去離子水和糖水消耗量,最后計(jì)算糖水消耗率(%)=糖水消耗量(mL)/(去離子水+糖水消耗量)mL×100%。使用實(shí)驗(yàn)室自制木箱,長(zhǎng)×寬×高為:100cm×100cm×40cm,內(nèi)面及底面均為黑色,中央?yún)^(qū)正上方安置攝像頭。實(shí)驗(yàn)前1天及造模第15天,每組大鼠分別進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前把動(dòng)物提前1h搬進(jìn)測(cè)試室適應(yīng)環(huán)境,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后,將大鼠放到中央?yún)^(qū)固定位置,每次放置頭部固定朝向一側(cè)。每只大鼠測(cè)量5min,測(cè)量指標(biāo)包括運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間中夾區(qū)進(jìn)入次數(shù),隨后用低濃度酒精清潔箱內(nèi)環(huán)境,等酒精揮發(fā)無(wú)味后,再進(jìn)行下1只。高架十字迷宮有兩條開(kāi)放臂(45cm×15cm)和封閉臂(45cm×15cm×30cm)組成,呈十字形交叉,中間由中央?yún)^(qū)連接(15cm×15cm),距離地面高50cm,4條臂的內(nèi)壁和底面均為深灰色,中央?yún)^(qū)平臺(tái)正上方安置攝像頭進(jìn)行錄像。錄像前,用遮光簾隔離燈光,防止高架十字底面反光,影響軟件分析,保持周?chē)h(huán)境安靜,避免打擾。造模前1天及第15天,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前1h將動(dòng)物搬進(jìn)測(cè)試室,讓動(dòng)物提前適應(yīng)周?chē)h(huán)境,開(kāi)始測(cè)試后,將動(dòng)物放到高架十字平臺(tái),使其頭部正對(duì)其中一側(cè)封閉臂,釋放后同時(shí)開(kāi)始錄像記錄大鼠5min的活動(dòng)情況,包括進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)、時(shí)間,封閉臂的進(jìn)入次數(shù)、時(shí)間等等。待1只大鼠測(cè)完后,用毛巾蘸低濃度酒精清理迷宮,等酒精揮發(fā)后,再進(jìn)行下1只測(cè)試。實(shí)驗(yàn)前將各組大鼠禁食24h,使用長(zhǎng)×寬×高為50cm×40cm×40cm的箱子,箱底中央?yún)^(qū)放置一小塊白紙,將小塊食物放置白紙上。同上述實(shí)驗(yàn)相同,實(shí)驗(yàn)前1h將動(dòng)物搬入測(cè)試室,適應(yīng)新環(huán)境。每次將動(dòng)物從箱子同一側(cè)箱角放入,開(kāi)始計(jì)時(shí),直到動(dòng)物開(kāi)始咬食,計(jì)時(shí)結(jié)束。擦洗箱內(nèi),更換白紙和食物,消除動(dòng)物之間相互影響,再?gòu)耐粋?cè)箱角放入動(dòng)物。記錄每只動(dòng)物從放入到開(kāi)始進(jìn)食的時(shí)間,觀察5min,如果計(jì)時(shí)結(jié)束,動(dòng)物還沒(méi)有進(jìn)食,按5min計(jì)算。運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,采用雙側(cè)檢驗(yàn)(P=0.05),數(shù)據(jù)均以u(píng)e0af±s表示,正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。各組大鼠一般情況造模7d,除正常組外,其余3組大鼠精神緊張,毛發(fā)凌亂,灌胃、束縛反抗劇烈,嘶叫掙扎;造模14d,正常組及用藥組大鼠精神狀態(tài)良好,毛發(fā)光澤明亮,較為整潔,活潑好動(dòng);模型組大鼠精神萎靡,毛發(fā)凌亂,色澤晦暗,喜蜷伏角落,耳尖明顯向背部方向靠攏;正常組及用藥組大鼠警惕性一般,不易激惹,眼神鎮(zhèn)定;模型組大鼠煩躁,警惕性高,容易激惹,目光焦灼,稍有聲響即成防御姿態(tài);正常組及用藥組大鼠叫聲較為柔和,反抗、對(duì)峙較弱,撕咬、掙脫次數(shù)較少;模型組大鼠對(duì)束縛反應(yīng)劇烈,反抗、撕咬束縛帶,嘶叫,極力掙脫。此外,模型組大鼠大便稀溏,正常組及用藥組大鼠大便干稀適中,呈球狀。造模前1天及造模后第7天,4組大鼠體質(zhì)量未見(jiàn)明顯差異。造模后第15天,與模型組相比,其余3組大鼠平均體質(zhì)量高于模型組,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異(P<0.05)。與正常組相比,逍遙散組及氟西汀組大鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,兩個(gè)治療組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。見(jiàn)表2。造模前1天各組大鼠糖水消耗率無(wú)顯著性差異,造模后第15天,各組大鼠糖水消耗率仍無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表3。各組大鼠運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)及停留時(shí)間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是,模型組大鼠的運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)相對(duì)較低,而逍遙散組和氟西汀組則與正常組較為接近。見(jiàn)表4。模型組在大鼠運(yùn)動(dòng)總距離、雙側(cè)開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)、雙側(cè)開(kāi)放臂停留時(shí)間、中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)方面明顯低于正常組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.01),而逍遙散組和氟西汀組該項(xiàng)目均高于模型組(P<0.05,P<0.01),雖然高于正常組但與正常組,比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。氟西汀組大鼠開(kāi)放臂停留時(shí)間和中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)均高于逍遙散組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表5。0天各組大鼠新環(huán)境進(jìn)食時(shí)間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而造模后第15天,模型組大鼠進(jìn)食時(shí)間明顯長(zhǎng)于其他3組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。兩個(gè)治療組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。慢性應(yīng)激模型大鼠一般情況關(guān)于如何建立起較為合理的焦慮動(dòng)物模型,目前應(yīng)用的造模方法有很多種,包括:高架十字迷宮、空瓶刺激、天敵暴露、飲水沖突等等,但是仍然存在很多不確定因素和干擾因素,比如:高架十字迷宮屬焦慮癥動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法,用于造模牽強(qiáng)人意;空瓶刺激設(shè)計(jì)較為簡(jiǎn)單化,并且尚未形成系統(tǒng)方法;天敵暴露對(duì)于動(dòng)物則更多的是恐懼情緒。因此,焦慮癥動(dòng)物模型的建立仍需要進(jìn)一步探討。與此相比,慢性應(yīng)激致動(dòng)物抑郁模型方法卻是得到世界公認(rèn),慢性不可預(yù)知溫和刺激(CUMS)、慢性不可預(yù)知刺激(CUS)以及本課題組多年來(lái)一直沿用的慢性束縛應(yīng)激模型方法長(zhǎng)期以來(lái)一直被廣泛使用。有研究表明,焦慮與抑郁往往伴發(fā)出現(xiàn),焦慮反應(yīng)和抑郁反應(yīng)之間可能僅僅存在一個(gè)時(shí)間跨度,短期的刺激可以導(dǎo)致焦慮,而在此基礎(chǔ)上的延長(zhǎng)刺激則可導(dǎo)致抑郁發(fā)生。因此,短期的慢性應(yīng)激刺激導(dǎo)致動(dòng)物焦慮樣行為值得探討。筆者查閱近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[7,8,9,10,11,12,13,14,15,16],經(jīng)過(guò)14d慢性應(yīng)激刺激,模型組大鼠體質(zhì)量明顯增長(zhǎng)緩慢,高架十字迷宮實(shí)驗(yàn),動(dòng)物開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)、開(kāi)放臂停留時(shí)間等均有顯著差異。然而,對(duì)于糖水消耗實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等主要反映動(dòng)物抑郁的行為學(xué)指標(biāo)則持有不同意見(jiàn)。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明,14d慢性應(yīng)激模型大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)與正常組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,只是可能存在一個(gè)變化趨勢(shì)。但是,21d慢性應(yīng)激行為學(xué)表明,模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分、穿格數(shù)、站立次數(shù)、修飾次數(shù)等均有顯著差異。從動(dòng)物行為學(xué)角度來(lái)看,14d慢性應(yīng)激大鼠多為焦慮大鼠模型,而21d慢性應(yīng)激則發(fā)展為抑郁模型。本實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)14d慢性束縛應(yīng)激,模型組大鼠食欲下降,飲食減少,加之大便稀溏,體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。糖水消耗是反應(yīng)動(dòng)物快感缺失的有效指標(biāo),雖然4組大鼠比較結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是相比其他3組,模型組的糖水消耗率下降更為明顯,說(shuō)明模型動(dòng)物興趣減退、快感缺失。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)均是利用動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探索特性和恐懼心理來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的自主行為、探究行為以及緊張度。其中,高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是國(guó)際公認(rèn)的評(píng)價(jià)動(dòng)物焦慮行為學(xué)指標(biāo)。新環(huán)境進(jìn)食抑制實(shí)驗(yàn)是利用動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的恐懼與對(duì)食物的極大需求形成的矛盾沖突來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的焦慮緊張程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,14d慢性束縛應(yīng)激可以導(dǎo)致大鼠焦慮。此外,結(jié)合模型組大鼠的一般狀態(tài)表現(xiàn),目光焦慮,喜蜷伏角落,精神緊張,易激惹,警惕性高,束縛灌胃時(shí)反抗劇烈,嘶叫明顯,大便稀溏,與焦慮癥患者的臨床癥狀,包括:緊張不安,急躁易怒,惶惶不可終日,有時(shí)乏力倦怠、心慌氣短等頗為相似。中醫(yī)辨證多為肝郁脾虛,兼有血虛證。逍遙散作為傳統(tǒng)中醫(yī)名方,一直在臨床上廣泛使用,具有疏肝解郁,健脾和營(yíng)的作用。方中柴胡疏肝解郁,加薄荷增強(qiáng)疏散條達(dá)之效;當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血柔肝,白術(shù)、茯苓益氣健脾,促進(jìn)氣血化生;干姜與歸、芍相配,調(diào)和氣血,與苓、術(shù)相配,調(diào)和脾胃;炙甘草配苓、術(shù)培補(bǔ)脾土,調(diào)和諸藥。該方治療情志疾病,不但可以調(diào)節(jié)抑郁,舒緩情志,而且可以緩解焦慮,放松心情。目前已經(jīng)有大量的臨床研究表明逍遙散治療廣泛性焦慮癥以及其他疾病并發(fā)焦慮癥療效確切,但是,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中尚較少提及。因此,本研究采用逍遙散作為觀察藥物。實(shí)驗(yàn)中將鹽酸氟西汀作為對(duì)照藥物進(jìn)行觀察,氟西汀作為一種選擇性血清(5-羥色胺)再吸收抑制劑(SSRI),具有較好的抗抑郁焦慮作用,臨床上常用來(lái)治療焦慮癥。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,氟西汀也常常用于研究觀察,Lapmanee等研究發(fā)現(xiàn),氟西汀能減輕應(yīng)激大鼠焦慮、抑郁樣行為。Santos等研究表明,通過(guò)高架十字迷宮、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)氟西汀能減少大鼠焦慮樣行為。盡管近年來(lái)偶有報(bào)道,氟西汀可能有增加焦慮樣行為的作用,但事實(shí)上,臨床研究發(fā)現(xiàn)氟西汀短期使用可能出現(xiàn)焦慮樣行為,但長(zhǎng)期應(yīng)用可以緩解焦慮癥狀。本研究從動(dòng)物行為學(xué)的角度評(píng)價(jià)了14d慢性應(yīng)激焦慮大鼠模型,而且使用鹽酸氟西汀作為對(duì)照藥,觀察了中藥逍遙散的抗焦慮作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,逍遙散具有改善大鼠焦慮樣表現(xiàn),增加模型大鼠體質(zhì)量,提高模型大鼠自主行為、探究行為,降低