現(xiàn)代生物技術(shù)總結(jié)

.頁(yè)眉.頁(yè)腳..現(xiàn)代生物技術(shù)概論1.人類社會(huì)發(fā)展的主要推動(dòng)力是什么？科學(xué)技術(shù)2.對(duì)人類社會(huì)發(fā)展起關(guān)鍵作用的科學(xué)技術(shù)有哪些？即四次技術(shù)革命第1次技術(shù)革命（18世紀(jì)中葉):以牛頓的經(jīng)典力學(xué)為背景，以紡織機(jī)械的革新為起點(diǎn)，以蒸汽機(jī)的廣泛應(yīng)用為標(biāo)志，實(shí)現(xiàn)了社會(huì)主導(dǎo)技術(shù)與社會(huì)技術(shù)基礎(chǔ)的變革。第2次技術(shù)革命（19世紀(jì)70年代）:以鋼鐵技術(shù)、內(nèi)燃機(jī)技術(shù)和電力技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用為主要標(biāo)志，尤其是電機(jī)的研制和電能的應(yīng)用。第3次技術(shù)革命（20世紀(jì)40年代）:以原子能技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)和空間技術(shù)為代表的新興技術(shù)的迅速發(fā)展掀起了第三次技術(shù)革命，而電子計(jì)算機(jī)技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展是第三次技術(shù)革命的主要標(biāo)志。第4次技術(shù)革命（20世紀(jì)70年代）:主要以信息技術(shù)、生物技術(shù)、材料與納米技術(shù)、航天技術(shù)為標(biāo)志。3.什么是生物技術(shù)？生物技術(shù)biotechnology,bioengineering：是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其它基礎(chǔ)學(xué)科，采用先進(jìn)的工程技術(shù)手段，按照人類的設(shè)想來(lái)改造生物體或加工生物原料，從而生產(chǎn)出滿足人類需要的產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。4生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)植物基因工程育種:①培育抗病蟲(chóng)作物②抗逆育種③抗除草劑育種④品質(zhì)改良(2)植物細(xì)胞工程①植物次級(jí)代謝產(chǎn)物:利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的植物次生代謝產(chǎn)物包括藥用成分、香料、色素、殺菌劑等,已經(jīng)成功地培養(yǎng)出了紫草寧、人參皂甙、紫杉醇、阿馬里新等一系列的天然植物次生代謝物質(zhì)植物次生代謝產(chǎn)品的市場(chǎng)潛能②快速無(wú)性繁殖③原生質(zhì)體融合④花粉、花藥和胚的培養(yǎng)⑤遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用⑥種質(zhì)資源保存(3)生物農(nóng)藥①我國(guó)科學(xué)家已首次利用除蟲(chóng)菊成功地開(kāi)發(fā)出無(wú)公害生物農(nóng)藥，天然除蟲(chóng)菊的加工產(chǎn)品成為除蟲(chóng)效果很好的無(wú)公害生物農(nóng)藥。②蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis,Bt)，是應(yīng)用最廣的殺蟲(chóng)細(xì)菌。Bt制劑年產(chǎn)量已由20世紀(jì)80年代的幾十噸增加至目前的2-3萬(wàn)噸。③白僵菌(beauveriabassiana)，是防治鱗翅目昆蟲(chóng)的真菌制劑。它是一種蟲(chóng)生真菌④昆蟲(chóng)病毒⑤生物肥料（菌肥）動(dòng)物基因工程育種:動(dòng)物分子育種技術(shù)主要包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、胚胎工程技術(shù)等。動(dòng)物繁殖新技術(shù)①人工受精及精液的冷凍保存②胚胎移植及胚胎的冷凍保存，也叫受精卵移植，即將良種母畜受精后的早期胚胎取出，移植到另一同種的生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新個(gè)體，俗稱人工受胎或借腹懷胎。③體外胚胎生產(chǎn)，即將原來(lái)在輸卵管內(nèi)進(jìn)行的精卵結(jié)合生成胚胎的過(guò)程人為地改在體外進(jìn)行。主要包括卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和胚胎培養(yǎng)。④胚胎分割技術(shù)，將一枚胚胎用顯微手術(shù)的方式分割成二分、四分或八分胚，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，然后移入受體子宮發(fā)育，可獲得同卵雙生或同卵多生后代。⑤性別控制技術(shù)，通過(guò)人為的操作，使動(dòng)物按人的愿望繁殖所需性別的后代。包括X精子和Y精子的分離，胚胎性別鑒定技術(shù)。(6)營(yíng)養(yǎng)全面的動(dòng)物飼料①DNA重組生長(zhǎng)激素的利用②利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)飼料添加劑，如酶制劑、添補(bǔ)氨基酸、飼用維生素、抗生素和益生菌等。③寡糖、寡肽類飼料添加劑或稱“益生素”。（7）動(dòng)物生物反應(yīng)器：主要是乳腺生物反應(yīng)器。未來(lái)石油的替代物乙醇乙醇作為燃料的優(yōu)點(diǎn)有：A產(chǎn)能效率高；B其燃燒時(shí)不產(chǎn)生CO等有毒物質(zhì)，污染低；C可通過(guò)微生物發(fā)酵大量生產(chǎn)，成本較低。乙醇主要由酵母菌以蔗糖和淀粉為原料進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生的。5.生物技術(shù)與安全性（1）對(duì)人、動(dòng)物的潛在危害:A致病性，B抗藥性，C食品安全性。（2）對(duì)生態(tài)環(huán)境潛在危害：A致病性和毒性，B生存競(jìng)爭(zhēng)力，C傳播擴(kuò)散能力，D遺傳變異能力，E遺傳轉(zhuǎn)移能力。（3）轉(zhuǎn)基因作物（4）生物武器：目前，世界上公認(rèn)的對(duì)人類危害最大的、最易散發(fā)的三種生物武器是：A炭疽桿菌，B天花病毒，C肉毒桿菌。6、植物組織培養(yǎng)(planttissueculture)：是指在無(wú)菌條件下，把離體的植物器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體等材料接種在人工培養(yǎng)基中，使其發(fā)育成完整植株的過(guò)程。其中，離體的植物器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)等材料一般稱為外植體(explant)。7、植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)：細(xì)胞全能性，細(xì)胞的脫分化與再分化細(xì)胞全能性：任何一個(gè)擁有完整細(xì)胞核的植物細(xì)胞都具有形成一個(gè)完整植株所必需的全部遺傳信息，在特定條件下表達(dá)可產(chǎn)生獨(dú)立的個(gè)體。細(xì)胞學(xué)說(shuō)：一切生物都是由細(xì)胞構(gòu)成的，細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能基本單位，細(xì)胞只能由細(xì)胞分裂而來(lái)。細(xì)胞分化：是指使單個(gè)細(xì)胞形成具有不同功能的組織或者器官的過(guò)程。脫分化：也叫去分化，已經(jīng)停止分化的細(xì)胞、組織、器官在離體培養(yǎng)條件下，逐漸失去其原來(lái)的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)其分生狀態(tài)，形成無(wú)組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)的過(guò)程。再分化，由脫分化產(chǎn)生的無(wú)組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)在離體培養(yǎng)條件的剌激下重新分化成具有不同結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞、組織、器官的過(guò)程，即再分化。8、培養(yǎng)基的類型①含鹽量較高的培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基。目前應(yīng)用最多的培養(yǎng)基。②硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基：B5、N6、SH培養(yǎng)基。其中B5適合葡萄、豆科、十字花科等培養(yǎng)，N6是單子葉植物花藥培養(yǎng)的培養(yǎng)基。③無(wú)機(jī)鹽中等含量的培養(yǎng)基：包括H、Nitsch、Miller培養(yǎng)基，適合于花藥培養(yǎng)。④無(wú)機(jī)鹽含量低的培養(yǎng)基：主要有White、WS培養(yǎng)基等，多用于生長(zhǎng)根培養(yǎng)。常用培養(yǎng)基配方(單位：mg/L)9、培養(yǎng)基的成分①大量元素②微量元素③有機(jī)成分④植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑⑤培養(yǎng)基的其它成分：凝固劑抗生素等⑥PH值，培養(yǎng)基的PH值一般為5.5—6.0，常用5.8。PH超過(guò)6.5，培養(yǎng)基過(guò)硬；低于5.0又不易凝固。一般用1mol/LNaOH或HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。母液：指培養(yǎng)液的濃縮液，也稱貯備液。一般將培養(yǎng)基配方擴(kuò)大10倍、20倍、100倍、200倍，甚至更高倍數(shù)的濃縮液。配制母液和培養(yǎng)基時(shí)一般使用純度較高的蒸餾水或去離子水。通常配成大量元素、微量元素、鐵鹽、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、有機(jī)物等母液。于2--4℃的冰箱中保存。10、培養(yǎng)基的配制及注意事項(xiàng)①準(zhǔn)備好稱量用的器具，按培養(yǎng)基配方及所要配制的數(shù)量計(jì)算好各成分的分量，取出母液并按順序擺好。②在可加熱容器內(nèi)加所配培養(yǎng)基數(shù)量1/3體積的蒸餾水，按量加入瓊脂或瓊脂粉，按計(jì)算好的母液添加量分別依次加入大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、其它物質(zhì)，最后加入適量蔗糖攪拌均勻。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑必須在高溫高壓滅菌后再加入。③加蒸餾水定容，攪拌均勻。并做好標(biāo)記，以防加熱時(shí)水分蒸發(fā)，造成體積減少。④調(diào)整PH值。用1mol/L的NaOH或HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)，一般為PH5.5—6.0，常用5.8。注意高溫高壓滅菌后，可使PH值降低0.3—0.5個(gè)單位。⑤分裝。一般占培養(yǎng)容器的1/4—1/3。注意不要讓培養(yǎng)基粘到培養(yǎng)瓶的內(nèi)壁和瓶口，容易引起污染。注意：做好標(biāo)記，配制日期及培養(yǎng)基種類。⑥封口。培養(yǎng)基分裝好后，一般用硫酸紙、耐高溫塑料蓋、封口膜等立刻封口，以防污染。11、高溫高壓滅菌注意事項(xiàng)：①滅菌鍋應(yīng)提前加入適量的水。②鍋內(nèi)待滅菌的培養(yǎng)基應(yīng)擺放平而不能傾斜。③鍋內(nèi)不要裝太滿。④鍋內(nèi)的冷氣必須排放出去。⑤對(duì)滅菌條件要嚴(yán)格控制。⑥滅菌完成后，應(yīng)緩慢排氣降壓，等壓力表指針回零，才能打開(kāi)鍋蓋。11、外植體的選擇原則①再生能力強(qiáng)。一般情況是分化程度越高的細(xì)胞，脫分化越難，再生能力越弱。所以常用幼嫩的組織。②遺傳穩(wěn)定性好。③來(lái)源豐富。④滅菌容易。⑤外植體的大小。一般為0.5—1cm。或更小，用于脫毒。試管苗移栽馴化由于試管苗的生長(zhǎng)環(huán)境不同于自然外界環(huán)境，因此其具有高濕、弱光、恒溫、低透氣性等特點(diǎn)。所以需要馴化后才能移栽。12、.人工種子：是指利用細(xì)胞的全能性，將植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或者具有發(fā)育成完整植株能力的分生組織（胚狀體、芽和莖段等）包埋在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并且具有保護(hù)功能的外殼內(nèi)，形成在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗的顆粒體。胚狀體(embryoid)或體細(xì)胞胚(somaticembryo)指在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，由非合子細(xì)胞經(jīng)胚胎發(fā)生、發(fā)育過(guò)程形成的具有胚芽、胚軸、胚根的胚狀結(jié)構(gòu)，具有發(fā)育成完整植株的能力。13、人工種子的結(jié)構(gòu)人工種子由胚狀體（胚類似物）、人工胚乳和人工種皮三部分組成。胚類似物，除了胚狀體以外，還包括組培過(guò)程中產(chǎn)生的愈傷組織、頂芽、腋芽、不定芽、原球莖和小鱗莖等繁殖體。人工胚乳，一般由供應(yīng)胚狀體養(yǎng)分的膠囊組成，其養(yǎng)分主要有礦質(zhì)元素、維生素、碳源、激素等，有時(shí)還添加殺蟲(chóng)劑、殺菌劑、除草劑和一些有益微生物。人工種皮，即膠囊之外的包膜，是人工種子的最外層部分。要求具有機(jī)械保護(hù)作用，同時(shí)又能通氣，但是又不能使水分和營(yíng)養(yǎng)成分流14、細(xì)胞培養(yǎng)，是指離體細(xì)胞在無(wú)菌條件下進(jìn)行分裂、生長(zhǎng)，但是在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織。15、組織培養(yǎng)，是指動(dòng)物的某類組織在體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞一直保持原來(lái)已分化的特性，其組織結(jié)構(gòu)和功能無(wú)明顯變化。16、細(xì)胞核移植，就是將哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞核移植到新的卵細(xì)胞中重新發(fā)育成個(gè)體的過(guò)程。細(xì)胞核移植主要用于異種細(xì)胞核質(zhì)關(guān)系研究和細(xì)胞核遺傳全能性研究。17、干細(xì)胞（stemcell），是動(dòng)物的胚胎及某些器官中具有自我修復(fù)和多向分化潛能的原始細(xì)胞，是修復(fù)病損或衰老組織和器官的理想種子細(xì)胞。即可用干細(xì)胞培養(yǎng)出來(lái)器官替換病人的相應(yīng)壞損器官。失。18、基因的時(shí)空表達(dá)是細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育的根本原因。？基因（gene）：染色體上具有特定結(jié)構(gòu)和功能的DNA片段。不同基因表達(dá)不同的蛋白質(zhì)，所以不同生物體表現(xiàn)出不同的性狀，即基因決定生物體的性狀?；蛞话愣及?'非轉(zhuǎn)錄區(qū)、起始密碼子、轉(zhuǎn)錄區(qū)、終止密碼子、3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)?；虻男再|(zhì)：A不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。B基因是可以切割的。C基因是可以轉(zhuǎn)移的。D基因與多肽之間是對(duì)應(yīng)的。E遺傳密碼是通用的。F基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞給后代。19、基因工程就是將目的基因插入到載體（質(zhì)粒、病毒）中，再把攜帶目的基因的載體轉(zhuǎn)入受體材料細(xì)胞中，使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)而使受體生物表現(xiàn)出目的基因的性狀。20、基因組文庫(kù)是將目標(biāo)生物的全部基因組DNA切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段并克隆到某種載體上而形成的集合。根據(jù)所用載體不同，基因組文庫(kù)分為以下幾種：質(zhì)粒文庫(kù)、噬菌體文庫(kù)、黏粒文庫(kù)、人工染色體文庫(kù)。基因組文庫(kù)的構(gòu)建步驟：①目標(biāo)植物基因組DNA提取及片段化②載體的選擇與制備③DNA片段與載體連接，噬菌體進(jìn)行離體包裝④重組體感染宿主細(xì)胞(大腸桿菌)⑤轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選放射性標(biāo)記探針進(jìn)行文庫(kù)雜交篩選21、cDNA文庫(kù)是將目標(biāo)生物某一發(fā)育時(shí)期或者是某一組織器官的全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并克隆到某載體上而形成的集合。22、mRNA差異顯示技術(shù)分離差異表達(dá)的基因：其基本原理：利用真核生物成熟mRNA的3′polyA結(jié)構(gòu)，用oligo(dT)12MN(其中M為錨定堿基，起增大引物Tm值的作用，M為A、C、G中的任意一種；其中的N為分類堿基，對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分類，M為A、C、G、T中的任意一種)作為錨定引物與mRNA的polyA結(jié)合，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將mRNA反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA的雜交分子，這一過(guò)程即差異顯示反轉(zhuǎn)錄，然后再用10bp的隨機(jī)引物與oligo(dT)12MN組成的引物對(duì)，以mRNA-cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，通過(guò)放射自顯影或顯色反應(yīng)即可獲得差異表達(dá)基因的擴(kuò)增條帶。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：在有DNA單鏈、引物、dNTPs、DNA聚合酶等條件下，DNA聚合酶即可從引物開(kāi)始沿單鏈DNA的5'3'合成其互補(bǔ)鏈，而PCR儀可以使這一反應(yīng)不斷進(jìn)行下去，直到條件不復(fù)存在。23、PCR反應(yīng)原理：RT-PCR即反轉(zhuǎn)錄PCR，以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈的過(guò)程。在已知目的基因cDNA序列的情況下可用此法來(lái)分離目的基因。RACE即cDNA末端的快速擴(kuò)增技術(shù)，用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到3'或5'端之間未知序列的方法。24、載體(vector)，即攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制、整合或表達(dá)的工具，根據(jù)其功能把載體分為克隆載體和表達(dá)載體。載體的改進(jìn)和創(chuàng)新是基因工程發(fā)展的重要內(nèi)容和標(biāo)志。載體分為克隆載體、表達(dá)載體、（1）克隆載體：即攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制或保存的載體，包括質(zhì)粒載體、噬菌體載體、黏粒載體、人工染色體克隆載體必須滿足以下條件：A可轉(zhuǎn)移性，即能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞。B可自主復(fù)制，能在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)目的基因的增殖。C多克隆位點(diǎn)，由單一的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)組成。D合適的選擇標(biāo)記，用于重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞篩選。（2）表達(dá)載體是可攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的載體。一般是在克隆載體的基礎(chǔ)上增加了基因表達(dá)調(diào)控的元件構(gòu)建而成。分為①原核表達(dá)載體②酵母表達(dá)載體③Ti質(zhì)粒表達(dá)載體25、核酸酶：可以切割雙鏈DNA分子中相鄰兩個(gè)核苷酸殘基之間磷酸二酯鍵，從而使核酸分子發(fā)生水解斷裂的酶。根據(jù)其水解方式不同分為外切核酸酶(exonuclease)和內(nèi)切核酸酶(endonuclease)。根據(jù)其底物不同又可分為RNA酶(RNase)和DNA酶(DNase)等。限制性內(nèi)切核酸酶(RE)：在各種細(xì)菌中均存在一種或多種能夠切割雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的酶。限制內(nèi)切酶和能識(shí)別相同位點(diǎn)的甲基化酶一起構(gòu)成了限制—修飾系統(tǒng)。DNA連接酶：是把不同雙鏈DNA片段的3'羥基末端與5'磷酸末端通過(guò)磷酸二酯鍵連接起來(lái)的酶。DNA連接酶的作用特點(diǎn)：A它不能連接兩條單鏈的DNA分子，被連接部分必須是雙鏈的一部分。B而且只能補(bǔ)平雙鏈DNA骨架上的缺口(nick)，而不能彌補(bǔ)雙鏈DNA上缺失的多個(gè)堿基所形成的裂口(gap)。C連接反應(yīng)必須發(fā)生在3'羥基末端與5'磷酸末端，其它末端不起作用。D連接反應(yīng)需要ATP或NAD+和Mg2+參與。DNA聚合酶(DNApolymerase)的作用是在模板和引物的存在下，把脫氧核糖單核苷酸連續(xù)地加到雙連DNA分子引物鏈的3'-OH端，催化核苷酸的聚合反應(yīng)。DNA聚合酶的種類、性質(zhì)及作用:27、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)，其是將核酸分子脫掉5'端的磷酸基團(tuán)，從而使DNA或RNA片段的5'-P轉(zhuǎn)換為5'-OH。主要用于DNA分子5'端的去磷酸化，防止自身連接；在5'末端標(biāo)記之前，去除DNA或RNA的5'端磷酸基團(tuán)。28.植物轉(zhuǎn)基因方法：（1）載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，主要包括農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法和病毒載體轉(zhuǎn)化法；（2）DNA直接導(dǎo)入法，即通過(guò)物理或化學(xué)方法直接導(dǎo)入植物細(xì)胞。物理法有基因槍法、電擊法、顯微注射法和激光微束法。化學(xué)法有PEG法和脂質(zhì)體法；（3）種質(zhì)系統(tǒng)法，包括花粉管通道法、生殖細(xì)胞浸泡法和胚囊子房注射法。其中的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法是目前植物基因工程中使用最好的方法。29、Ti質(zhì)粒都含有以下四個(gè)區(qū)，即T-DNA區(qū)、Vir區(qū)、Con區(qū)、Ori區(qū)。①T-DNA區(qū)：它是農(nóng)桿菌侵染植物時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)并轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)的一段DNA，所以稱為轉(zhuǎn)移DNA。T-DNA長(zhǎng)約23kb，其中有8-9kb的保守區(qū)，也稱核心序列。在植物基因組中沒(méi)有找到與T-DNA同源的序列存在，而且T-DNA僅存在于植物腫瘤細(xì)胞的核DNA中。T-DNA的轉(zhuǎn)移與T-DNA區(qū)域的其它基因和序列無(wú)關(guān)，這對(duì)外源基因的插入是非常有利的。T-DNA上攜帶的基因與腫瘤的形成有關(guān)。②Vir區(qū)：該區(qū)域的基因能激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，所以稱為毒性區(qū)。③Con區(qū)：該區(qū)域上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因(tra)，冠癭堿能激活tra表達(dá)并進(jìn)一步調(diào)節(jié)Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移，所以稱為接合轉(zhuǎn)移區(qū)。④Ori區(qū)：該區(qū)域的基因是調(diào)節(jié)Ti質(zhì)粒自我復(fù)制的起始區(qū)域。30、外源基因整合的southern雜交鑒定證明外源基因整合到植物染色體上的最可靠的方法就是分子雜交，只有經(jīng)分子雜交鑒定過(guò)的轉(zhuǎn)基因株系才能稱為轉(zhuǎn)基因植物。Southern雜交原理：轉(zhuǎn)基因植物gDNA中是否含有外源基因？我們用與外源基因同源的互補(bǔ)序列做為探針，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈DNA分子的過(guò)程。其中的探針是用同位素或者酶或地高辛等人為標(biāo)記好的，可通過(guò)某種特定方法檢測(cè)出來(lái)的。同樣也可檢測(cè)到探針與互補(bǔ)外源基因的雜合體，即從轉(zhuǎn)基因植物基因組中找到其同源序列。因此，southern雜交是當(dāng)前鑒定外源基因整合的權(quán)威方法。Southern雜交的程序：①探針的選擇與標(biāo)記：A當(dāng)檢測(cè)目的基因是否整合及拷貝數(shù)時(shí)，以目的基因?yàn)樘结樧詈茫蝗舴治鐾庠椿虻氖菃吸c(diǎn)插入還是多點(diǎn)插時(shí)，除目的基因探針外還需要T-DNA邊界序列探針或標(biāo)記基因或報(bào)告基因探針。B無(wú)論是哪種探針都需要以載體質(zhì)粒(T-載體、Ti-質(zhì)粒)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)及純化回收，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定PCR產(chǎn)物的濃度(OD260×稀釋倍數(shù)×50ug/ml)。C探針標(biāo)記效率及濃度檢測(cè)②基因組DNA提取基因組DNA酶切電泳轉(zhuǎn)膜雜交信號(hào)檢測(cè)31、外源基因轉(zhuǎn)錄的northern雜交檢測(cè)Northern雜交原理：外源基因如果正常表達(dá)，在轉(zhuǎn)化植株的細(xì)胞內(nèi)將有其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異mRNA生成。提取其總RNA或mRNA并進(jìn)行變性凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并與標(biāo)記好的探針雜交形成DNA-RNA的雜合體。通過(guò)探針上的標(biāo)記可檢出目的mRNA。Northern雜交程序：①探針制備A探針選擇：檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄的mRNA應(yīng)使用同源的DNA探針，雜交后形成DNA-RNA雜合體；也可使用cDNA探針。B探針序列的獲得：人工合成、PCR方法、質(zhì)粒酶切法。C探針標(biāo)記：切口平移法等。②轉(zhuǎn)化植株總RNA的提取。RNA純度分析：A260/A280=1.7—2.0；<1.7，有蛋白或酚污染。A260/A230>2.0；若<2，表明有異硫氰酸胍污染，用異丙醇重新沉淀。RNA濃度計(jì)算：RNA(ug/ml)=A260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml③mRNA分離：柱層析法④電泳甲醛變性電泳單鏈RNA，其鏈內(nèi)堿基易通過(guò)氫鍵形成二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)。而甲醛與堿基結(jié)合后形成具有一定穩(wěn)定性的復(fù)合物，阻止了堿基配對(duì)，使RNA保持線性，電泳時(shí)才與分子量標(biāo)記成正比。⑤轉(zhuǎn)膜—烘膜—雜交—信號(hào)檢測(cè)—結(jié)果分析32、外源基因表達(dá)蛋白質(zhì)的檢測(cè)常用的檢測(cè)目的基因表達(dá)蛋白的方法即western雜交。Western雜交原理：若目的基因正常表達(dá)，則在轉(zhuǎn)基因植物中含有一定量的目的蛋白。從轉(zhuǎn)基因植物中提取總蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)按分子大小分離，將分離的各蛋白質(zhì)條帶原位轉(zhuǎn)印到固相膜上，膜在高濃度的蛋白質(zhì)溶液中溫育，以封閉非特異性位點(diǎn)。加入特異抗體(一抗)，印跡上的目的蛋白(抗原)與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗專一結(jié)合的標(biāo)記好的二抗，最后通過(guò)二抗上的標(biāo)記化合物的性質(zhì)進(jìn)行檢出。Western雜交程序：①探針制備與標(biāo)記探針是與目的蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)蛋白，即抗體，也稱一抗。②植物蛋白質(zhì)的提取首先，也需要進(jìn)行液氮冷凍研磨，然后加入樣品體積3—6倍的提取緩沖液，混勻后離心，上清液即為總蛋白樣品液。③聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)④蛋白質(zhì)印跡⑤雜交與檢出動(dòng)物基因工程：將目的基因?qū)雱?dòng)物的受精卵，使其與受體動(dòng)物自身的基因組DNA整合到一起，并隨細(xì)胞的分裂而增殖，從而在動(dòng)物體內(nèi)得到表達(dá)，產(chǎn)生具有目的基因表達(dá)性狀的個(gè)體。34、生物多樣性：是地球上的所有生物體及其所構(gòu)成的綜合體。包括遺傳多樣性、物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性和景觀多樣性。其中遺傳多樣性是核心。35、遺傳多樣性：指每一物種內(nèi)基因型的多樣性，即種內(nèi)的基因變化，因此也稱基因多樣性。物種的遺傳多樣性可從形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞學(xué)特征、生理生化特征和DNA序列特征等四個(gè)層次來(lái)標(biāo)記區(qū)別。36、遺傳標(biāo)記：指可追蹤的染色體或染色體上的某一段或某個(gè)基因座在家系中可傳遞的任何一種遺傳特性，是遺傳多樣性的表示方法。遺傳標(biāo)記具有可遺傳性和可識(shí)別性兩個(gè)基本特征。有4種類型，即形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記。37、可被利用的遺傳標(biāo)記應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：A多態(tài)性高；B表現(xiàn)為共顯性；C對(duì)農(nóng)藝性狀影響??；D經(jīng)濟(jì)方便，容易觀察記載。共顯性：雜合子的一對(duì)等位基因都具有各自的表型效應(yīng)，當(dāng)這一對(duì)等位基因雜合時(shí)，有兩種表現(xiàn)型共存。便于區(qū)別的純合基因型與雜合基因型。共顯性標(biāo)記，即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型,一般認(rèn)為共顯性標(biāo)記可有效地剔除雜合基因型。38、形態(tài)標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單直觀、經(jīng)濟(jì)方便。缺點(diǎn)：形態(tài)標(biāo)記的數(shù)量在多數(shù)植物中是很有限的，而且多態(tài)性也較差；表現(xiàn)易受環(huán)境影響；同時(shí)有些形態(tài)標(biāo)記與有害或不利性狀相連鎖；另外形態(tài)標(biāo)記的獲得需要通過(guò)誘變、分離純合的過(guò)程，周期較長(zhǎng)。因此形態(tài)標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用是有限的，39、作為理想的形態(tài)標(biāo)記的性狀必須具有以下特征：A具有明顯的、容易識(shí)別的特征。B本身無(wú)致命缺陷，如無(wú)致死性、產(chǎn)量極低等。C與普通品種的雜交后代無(wú)明顯劣勢(shì)，如無(wú)質(zhì)量下降、產(chǎn)量降低等現(xiàn)象。D隱性性狀較好，顯性性狀應(yīng)無(wú)明顯缺陷。40、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記：是指能夠明確揭示遺傳多樣性的細(xì)胞學(xué)特征。染色體作為遺傳物質(zhì)的載體。生化標(biāo)記：能夠反應(yīng)生物變異和生物多樣性的生化特征。蛋白質(zhì)標(biāo)記是目前主要的生化標(biāo)記，包括同工酶(由不同基因座編碼的酶的不同形式)標(biāo)記、等位酶(由一個(gè)基因座中的不同等位基因編碼的酶的不同形式)標(biāo)記、種子貯藏蛋白標(biāo)記和免疫學(xué)標(biāo)記。41、分子標(biāo)記：指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。它能反應(yīng)生物個(gè)體或種群間基因組上的某種差異特征，因此可作為一種遺傳標(biāo)記。分子標(biāo)記優(yōu)越性：①直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問(wèn)題；②數(shù)量極多，遍布整個(gè)基因組，可檢測(cè)的座位幾乎是無(wú)限的；③多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無(wú)需人為創(chuàng)造；④表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；⑤許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。DNA分子標(biāo)記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)。42、DNA分子標(biāo)記的應(yīng)用：①分子遺傳圖譜構(gòu)建②遺傳多樣性性分析與種質(zhì)鑒定③重要農(nóng)業(yè)農(nóng)藝性狀的基因定位與圖位克?、苻D(zhuǎn)基因植物鑒定⑤分子標(biāo)記輔助選擇43、RFLP標(biāo)記技術(shù)原理：利用一種限制性內(nèi)切酶酶解不同品種或同一品種的不同個(gè)體的DNA，由于目標(biāo)DNA既有同源性又有變異，因而酶切片段長(zhǎng)度就有差異，不同材料顯示的雜交帶位置也有差異，這種差異就是RFLP。44、RAPD標(biāo)記技術(shù)原理：RAPD只需要一個(gè)10bp左右的引物。由于基因組DNA分子中可能存在或長(zhǎng)或短的被間隔開(kāi)的顛倒重復(fù)序列，因此在兩條單鏈DNA上就各有一個(gè)引物結(jié)合部位，構(gòu)成單引物PCR擴(kuò)增的模板。不同DNA中的這種顛倒重復(fù)序列的數(shù)目及間隔的長(zhǎng)短不同，擴(kuò)增的條帶也不同，即出現(xiàn)多態(tài)性。一般長(zhǎng)度為400—2000bp的擴(kuò)增片段在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)為條帶。45、AFLP標(biāo)記技術(shù)原理（了解）：由于不同物種的基因組大小不同，基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生的限制性片段的分子量大小不同。使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，用含有選擇性堿基的引物對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性，所以只有那些限制性位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無(wú)來(lái)檢出多態(tài)性。46、SSR標(biāo)記技術(shù)原理：SSR標(biāo)記即簡(jiǎn)單序列重復(fù)或者微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA)，一般為2—6個(gè)堿基組成的基序(motif)串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長(zhǎng)度一般較短，在100bp以內(nèi)。微衛(wèi)星主要以兩個(gè)堿基為重復(fù)單元，也有些是三個(gè)堿基的，四個(gè)堿基的更少，如(GT)n、(AT)n、(GGC)n、(GACA)n等重復(fù)序列，在植物基因組中以(AT)n最多。它們廣泛分布于各類真核生物基因組的不同位置，平均每10kb的DNA序列中就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)微衛(wèi)星序列。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來(lái)，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長(zhǎng)度多態(tài)性。SSR標(biāo)記高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不同。47、SNP標(biāo)記技術(shù)原理在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。通常所說(shuō)的SNP都是2個(gè)等位多態(tài)性(一個(gè)SNP位點(diǎn)只有兩種等位基因)，這種多態(tài)性只涉及單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(包括C與T互換，在其互補(bǔ)鏈上則是G與A互換)或顛換(包括C與A、G與T、C與G、A與T互換)所引起，也可以由堿基的插入或缺失所致。生物信息學(xué)是一門交叉科學(xué)，它包含了生物信息的獲取、加工、存儲(chǔ)、分配、分析、解釋等在內(nèi)的所有方面，它綜合運(yùn)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)的各種工具，來(lái)闡明和理解大量數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義。信息檢索(informationretrieval)是指將無(wú)序的數(shù)據(jù)有序化，形成信息集合，并根據(jù)需要從信息集合中查出特定信息的過(guò)程，包括信息存儲(chǔ)與檢索。50、除草劑的除草原理：根據(jù)除草劑在植物體內(nèi)的移動(dòng)情況分類（1）觸殺型除草劑：藥劑與雜草接觸時(shí)，只殺死與藥劑接觸的部分，起到局部的殺傷作用，植物體內(nèi)不能傳導(dǎo)。只能殺死雜草的地上部分，對(duì)雜草的地下部分或有地下莖的多年生深根性雜草，則效果較差。如除草醚、百草枯等。（2）內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑：藥劑被根系或葉片、芽鞘或莖部吸收后，傳導(dǎo)到植物體內(nèi)，使植物死亡。如草甘膦、撲草凈等。（3）內(nèi)吸傳導(dǎo)、觸殺綜合型除草劑：具有內(nèi)吸傳導(dǎo)、觸殺型雙重功能，如殺草胺等。51、MS培養(yǎng)基的特點(diǎn):MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和生理需要,因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。52、激素加入的作用：生長(zhǎng)素：主要用于誘導(dǎo)愈傷組織的形成、根的分化及細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)。常用培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素類物質(zhì)有IAA、IBA、NAA、2,4-D、ABT生根粉等。細(xì)胞分裂素，用于促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成。常用的細(xì)胞分裂素有6-BA、2-ip、ZT、KT等。赤霉素(GA)，其可加速細(xì)胞的伸長(zhǎng)和打破休眠。常用的赤霉素是GA3。脫落酸(ABA)，對(duì)體細(xì)胞胚的發(fā)生和發(fā)育有重要作用。由于ABA有促進(jìn)休眠、抑制生長(zhǎng)的作用，也常用二超低溫保存中。表達(dá)蛋白：蛋白表達(dá)是指用模式生物如細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或者植物細(xì)胞表達(dá)外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)。在基因工程技術(shù)中占有核心地位瓊脂糖凝膠電泳制備及注意事項(xiàng)

凝膠電泳操作注意事項(xiàng)：

1.緩沖系統(tǒng)：在沒(méi)有離子存在時(shí)，電導(dǎo)率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。長(zhǎng)時(shí)間高壓電泳時(shí)，常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的。

2.瓊脂糖：不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。

3.凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。

4.樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過(guò)多的量會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對(duì)于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。

5.電泳系統(tǒng)的變化會(huì)影響DNA的遷移，加入DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行判定是必要的。

6.DNA樣品中鹽濃度會(huì)影響DNA的遷移率，平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。

7.DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有