臨床應用和臨床試驗中的脂質(zhì)體納米粒概述

脂質(zhì)體納米粒概述引言納米藥品是納米技術、藥學和生物醫(yī)學科學的融合，并隨著用于疾病治療、顯像劑和治療診療應用的新型納米制劑的設計而快速發(fā)展。美國食品和藥品管理局（FDA）對納米制劑的定義是與1-100納米（nm）范疇內(nèi)的納米顆粒組合的制劑；或尺寸在此范疇之外卻顯示出尺寸有關特性的制劑型式。與游離藥品分子相比，這些制劑含有許多優(yōu)點，增加了溶解度、藥代動力學和療效得到改善、毒性最小化。已經(jīng)上市的納米藥品已有50中，涉及多個納米制劑，脂質(zhì)納米粒是其中的佼佼者。脂質(zhì)納米粒是多組分脂質(zhì)系統(tǒng)，普通包含磷脂、可電離脂質(zhì)、膽固醇和聚乙二醇化脂質(zhì)。傳統(tǒng)類型的脂質(zhì)納米粒是指脂質(zhì)體，由英國血液學家AlecDBangham在1961年初次提出。通過采用負染劑染色磷脂，能夠在電子顯微鏡下觀察脂質(zhì)體。這些磷脂構成磷脂雙分子層，進而形成球形。隨即，在1980年，第一種由活性靶向配體修飾的靶向脂質(zhì)體被開發(fā)出來，其能夠增加藥品在靶組織器官細胞中的累積，使藥品不會釋放到其它部位，這使得脂質(zhì)體的能力大大提高。與傳統(tǒng)脂質(zhì)體相比，這些脂質(zhì)體的總體療效得到改善。盡管通過30年的探索，脂質(zhì)體已經(jīng)能夠作為多個藥品分子的有效載體，但直到20世紀90年代，美國食品和藥品管理局（FDA）才初次同意脂質(zhì)體藥品。這一里程碑是Doxil，它是一種包裹阿霉素的“隱形”脂質(zhì)體（圖1a），其用于卵巢癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌以及多個形式的骨髓瘤的臨床治療。由于阿霉素被包裹在聚乙二醇脂質(zhì)體中，游離阿霉素的副作用（涉及慢性心肌病和充血性心力衰竭）明顯減輕。另外，Doxil中的聚乙二醇化脂質(zhì)體能夠延長該藥品給藥后在血液中的循環(huán)時間。在此之后，被動靶向至腫瘤?？偟膩碚f，由于增強滲入和滯留（EPR）效應，Doxil與游離阿霉素相比，明顯減少心臟毒性并增強抗癌能力。21世紀以來，多組分制劑出發(fā)發(fā)生了根本變化，納米制劑獲得極大的進展。這些多組分處方開始用于傳遞基因治療藥品寡核苷酸。這些寡核苷酸是大分子，體現(xiàn)出比常規(guī)化療更高的治療指數(shù)，特別是當這些制劑通過特殊設計時，能夠達成特定組織時?；騻鬟f面臨的重要挑戰(zhàn)是裸核酸在生理介質(zhì)中的不穩(wěn)定性。因此，開發(fā)適宜的處方以確保其足夠的體內(nèi)穩(wěn)定性和組織靶向能力至關重要。這一進步是在獲得的，F(xiàn)DA同意了Onpattro（AlnylamPharmaceuticals,Inc.,Cambridge,MA,USA）和SanofiGenzyme（Cambridge,MA,USA），由脂質(zhì)體納米粒子（LNPs）包裹siRNA而獲得（圖1a），用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素介導的淀粉樣變性患者的多發(fā)性神經(jīng)病。該LNP由DLin-MC3-DMA脂質(zhì)（構造見圖1b）、二聚芳基磷脂酰膽堿（DSPC）、膽固醇和PEG脂質(zhì)（PEG-DMG）構成，PEG脂質(zhì)在體內(nèi)將顆粒靶向肝細胞。在酸性介質(zhì)（pH~4）中，LNP中的陽離子脂質(zhì)體能夠通過靜電作用與核苷酸形成復合物。在生理pH值7.4，該制劑會帶中性電荷，從而更隱蔽，從而克制與其血液成分的互相作用。當這些LNP被細胞內(nèi)化時，這些構造脂質(zhì)帶正電，從而增進其與帶負電的內(nèi)溶酶體膜的復合。這種與細胞組分的互相作用會破壞脂質(zhì)體并將核酸釋放到胞漿中，從而發(fā)揮作用。研究表明，可電離脂質(zhì)的構造和pKa對藥品向靶細胞的輸送效率有至關重要的作用。例如，Onpattro中的可電離脂質(zhì)（Dlin-MC3-DMA）（圖1b）的pKa為6.44，其藥品遞送效率比pKa為6.7的Dlin-KC2-DMA高10倍。然而，應注意的是，脂質(zhì)構造的細微差別可造成LNP的組裝構造發(fā)生變化，從而造成不同的形態(tài)和藥品遞送狀況。為了提高顆粒穩(wěn)定性，處方中加入了含有兩個飽和酰基鏈和一種大頭基的DSPC（圖1b）。這些脂質(zhì)產(chǎn)生圓柱形幾何形狀，并在LNP中發(fā)揮輔助脂質(zhì)的作用，以維持外層構造并增進Onpattro的形成。顆粒表面的PEG-DMG脂質(zhì)（圖1a，b）由于隱形特性避免顆粒聚集，并延長體內(nèi)循環(huán)時間。總之，這種LNP系統(tǒng)含有堅實的核心構造、生理介質(zhì)中的低表面電荷和低免疫原性。這項技術引發(fā)了人們對進一步開發(fā)基因療法和新型給藥系統(tǒng)的愛好。脂質(zhì)納米粒是一種特別有前途的基因傳遞載體，其生物相容性高于聚合物納米粒和無機納米粒，含有固有的滲入能力、生物降解性、構造靈活性和低免疫原性。這些納米構造也能夠快速大規(guī)模生產(chǎn)，這是進入臨床實驗和商業(yè)應用的一種重要優(yōu)勢。自從Doxil、Onpattro和多個其它LNP在臨床實驗中獲得成功以來，已經(jīng)開展了大量研究，將研發(fā)成果轉(zhuǎn)化為商業(yè)產(chǎn)品。本綜述介紹了FDA同意的多個脂質(zhì)納米粒，并提出我們對將來發(fā)展機遇和挑戰(zhàn)的見解。特別地，我們首先對脂質(zhì)納米粒及其構造性質(zhì)關系進行概述。然后，我們研究了已成功用于癌癥藥品輸送的脂質(zhì)納米粒。我們還討論了更具挑戰(zhàn)性的遺傳物質(zhì)的傳遞，以及它在防止性病毒疫苗和治療性癌癥疫苗（涉及免疫療法）中的應用。圖1.（a）FDA同意的首個脂質(zhì)體Doxil和首個脂質(zhì)體納米粒Onpattro的構造；（b）Doxil和Onpattro的中脂質(zhì)的化學構造脂質(zhì)納米粒概述根據(jù)制備辦法和制劑的物理化學性質(zhì)，脂質(zhì)納米?？煞譃?類。它們是脂質(zhì)體（liposome）、非離子表面活性劑脂質(zhì)體（niosome）、轉(zhuǎn)移體（tansfersome）、固體脂質(zhì)納米粒（SLN）和納米構造脂質(zhì)載體（NLC）。圖2和表1描述了每種類型顆粒的重要特性。簡言之，由磷脂和膽固醇構成的脂質(zhì)體含有強大的藥品保護能力和靶向能力。與處在循環(huán)系統(tǒng)的游離藥品相比，這些特性使得脂質(zhì)體含有更低的毒性和更加好的療效。但是脂質(zhì)體在角質(zhì)層中缺少穿透能力，其在皮膚給藥中的應用受到了限制。其它缺點涉及親水性藥品的包封性差，以及由于藥品在介質(zhì)中泄漏而造成的儲存穩(wěn)定性差。非離子表面活性劑脂質(zhì)體（niosome）的是一種脂質(zhì)體的類似物，是由非離子表面活性劑和膽固醇在水相條件下形成的脂質(zhì)體，它比脂質(zhì)體含有更加好的穩(wěn)定性和更長的貨架期。另外，與帶正電的脂質(zhì)體相比，它們的中性殼含有相容性。盡管含有優(yōu)越的性質(zhì)，但由于缺少離子排斥作用，非離子表面活性劑脂質(zhì)體也會發(fā)生藥品泄漏和顆粒聚集，這始終是FDA同意的障礙。轉(zhuǎn)運體是由磷脂、邊沿激活劑（EA）和膽固醇構成的彈性或可變形納米顆粒。EA的加入增強了它們的柔韌性，增進了其組織滲入性。轉(zhuǎn)運體包載親脂性分子時，含有最高的穿透能力和包封效率。它們的氧化降解和高昂的材料成本仍然是大量生產(chǎn)這類顆粒的挑戰(zhàn)。全部這些含有親水核的親脂性雙層多層納米顆粒都能夠在沒有化學干預的狀況下包載親水性和疏水性藥品。疏水性藥品優(yōu)先夾在外部雙層中，而親水性分子則進入水腔中（圖2）。因此，這些顆粒被認為是廣譜藥品的有效載體，能夠?qū)λ幤诽峁┳銐虻谋Ｗo、實現(xiàn)可持續(xù)的藥品釋放和提高的生物運用度。脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有限、毒性、低載藥能力和復雜制造有關的缺點引發(fā)了研究人員的愛好，致力于開發(fā)了一類旨在提供包載效率的新型顆粒。固體脂質(zhì)納米粒（SLN，圖2）由固體脂肪和表面活性劑制成，形成含有固體脂質(zhì)核和單層殼的球形納米粒。與脂質(zhì)體相比，由于固體脂質(zhì)納米粒沒有親水核，對疏水性藥品的包封效率更高。與脂質(zhì)體和聚合物納米顆粒相比，這種剛性核還提高了SLN的穩(wěn)定性。事實上，水介質(zhì)中的SLN最少能夠儲存3年。SLN的生產(chǎn)不需要有機溶劑，從而消除了溶劑殘留引發(fā)的毒性風險。另外，SLN能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的能力和良好的重現(xiàn)性是下游商業(yè)和臨床應用的重要特性。在SLN之后，納米構造脂質(zhì)載體（NLC）已被開發(fā)用于增強藥品包載和避免藥品泄漏。NLC由非構造脂質(zhì)內(nèi)部和單層表面活性劑外圍構成（圖2）。與SLN由于固體晶格造成載藥量趨于飽和不同，NLC的核心由固體和液體脂質(zhì)的混合物構成，形成不完美的內(nèi)部結(jié)晶能夠增加載藥量。另外，NLC中的這種液相能夠在儲存期間克制藥品釋放。另外，脂質(zhì)-聚合物雜化納米顆粒也得到了研究，以實現(xiàn)脂質(zhì)基納米顆粒和聚合物顆粒之間產(chǎn)生協(xié)同作用。事實上，張等人比較了用于包載順鉑的脂質(zhì)納米粒、聚合物納米粒和兩者的雜化納米粒，體內(nèi)數(shù)據(jù)表明載順鉑的脂質(zhì)-聚合物雜化納米粒能最有效地克制卵巢癌。另外，在基因傳遞應用中也考慮了這些雜化粒子。通過優(yōu)化脂質(zhì)納米粒的性質(zhì)，能夠控制其安全性、包封能力、穩(wěn)定性、藥代動力學、生物分布和治療獲益。圖2.常見5種脂質(zhì)體納米粒的示意圖表1常見類型的脂質(zhì)體納米粒的重要特點總結(jié)表類型構成形狀/尺寸制備優(yōu)點缺點脂質(zhì)體（Liposome）磷脂，膽固醇，必需油球形，10-1000nm機械分散，溶劑分散，Detergentremoval保護藥品，控制釋放，增加疏水藥品的溶解度，生物運用度高，生物分布優(yōu)秀無法透過角質(zhì)層屏障，剛性構造非離子表面活性劑脂質(zhì)體（Niosome)膽固醇，非離子表面活性劑球形，10-1000nm超聲，微流體，醚注射法，起泡法靶向特定的位置，比脂質(zhì)體的穩(wěn)定性更加好且貨架期更長藥品泄露，粒子聚集，成本高，F(xiàn)DA同意的高分子材料稀缺轉(zhuǎn)運體（Tansfersome)磷脂，邊沿激活劑球形，＜300nm旋轉(zhuǎn)膜揮發(fā)法，反向溶劑揮發(fā)法高滲入性，高穩(wěn)定性容易氧化降解，成本高，磷脂包含天然雜質(zhì)固體脂質(zhì)體納米粒（Solidlipidnanoparticles）固體脂質(zhì)，表面活性劑球形，50–1000nm微乳化法，超聲法，高壓均質(zhì)法生物相容和可生物降解的輔料，細胞攝取高，在酸性pH下能夠提供良好的藥品包含，貨架期長，容易捕獲藥品有凝膠化趨勢納米構造脂質(zhì)體載體（Nanostructuredlipidcarriers）固體和液體脂質(zhì)（脂肪和油），表面活性劑含有固體脂質(zhì)體的全部優(yōu)點但載藥率更高，更為持久的藥品釋放，更加好的利尿活性，儲存期間藥品損失更小需要優(yōu)化固體/液體脂質(zhì)的比例2.2.決定脂質(zhì)納米粒傳遞效率的性質(zhì)對于寡核苷酸的遞送，納米顆粒需要包載足量的核酸，并含有特定的組織靶向性。因此，對脂質(zhì)納米顆粒的優(yōu)化是調(diào)控藥品遞送至不同部位的核心。構造決定因素，如粒徑、表面電荷、聚乙二醇化和表面修飾的靶向配體，已證明是決定這些納米顆粒輸送效率的核心因素。小尺寸納米顆粒已被證明有助于血液和毛細血管中的運輸以及組織的攝取。更具體地說，粒徑不大于10nm的納米粒子最適合擴散到毛細血管中，而10~100nm的顆粒更傾向于通過對流被毛細淋巴管吸取。當尺寸為100~200nm時，其快速擴散的能力減少。Oussoren等人的一項研究證明，皮下注射后，40nm脂質(zhì)體比粒徑更大的粒子含有更高的淋巴吸取。這些被注射的40nm脂質(zhì)體有76%被淋巴結(jié)攝取，而較大粒徑的脂質(zhì)體則被保存在皮下注射部位。對于肝靶向，系統(tǒng)給藥后，只有100nm的顆粒能夠通過肝窗擴散到肝細胞和肝星狀細胞。這些成果表明，小尺寸脂質(zhì)體可增強淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力，并可穿透肝窗以靶向肝細胞。對于大尺寸脂質(zhì)體（＞150nm），這些納米粒子被注射部位的抗原呈遞細胞（APC）吸取，然后被運輸?shù)搅馨徒Y(jié)。已有研究表明它們在淋巴結(jié)內(nèi)獲得了更高的細胞親和力。就脂質(zhì)納米粒的電荷效應而言，很難得出普通結(jié)論。Mai等人報道稱，在微血管網(wǎng)絡內(nèi)，陰離子和陽離子脂質(zhì)體與B細胞的結(jié)合程度明顯高于不帶電荷的脂質(zhì)體。這一現(xiàn)象能夠用類似的陰離子、陽離子脂質(zhì)體外殼的補體蛋白能夠與B細胞互相作用來解釋。陽離子脂質(zhì)體與B細胞受體的互相作用和內(nèi)化程度最高。陽離子脂質(zhì)體在血液中被調(diào)理素修飾，從而被人體免疫細胞識別。陰離子脂質(zhì)體重要附著在B細胞表面。這一發(fā)現(xiàn)表明，荷電脂質(zhì)體可能適合于疫苗應用，而中性粒子可能更適合于化療藥品的遞送。中村等發(fā)現(xiàn)30nm帶負電的LNP能夠比帶正電和中性粒子更有效地靶向淋巴結(jié)。成果表明，淋巴結(jié)中20~30%的B220+細胞被中性和帶正電的LNP標記，而幾乎80%的B220+細胞被帶負電的LNP標記。與中性和陰離子粒子相比，陽離子粒子在注射部位的保存更為明顯。這種效應是由于陽離子LNP和帶負電組織之間的高靜電互相作用。另外，據(jù)報道，陽離子LNP與血漿蛋白非特異性結(jié)合，并與較高的免疫原性有關?？偠灾?，帶正電的LNP含有很強的細胞親和力，但功效有限，而帶負電的LNP則能被有效地轉(zhuǎn)運到淋巴結(jié)。為了運用這種電荷特性，Hirai等人設計了電荷可逆LNP，這使得其在基因傳遞方面能夠?qū)崿F(xiàn)兩全其美。這些LNP由二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、膽固醇和二油酰甘油磷酸二乙二胺結(jié)合物（DOP-DEDA）構成，在pH值為6.0時帶正電，在pH值為7.4時帶中性，在pH值為8.0時帶負電。該系統(tǒng)在血液中是中性的，以最大程度地減少血漿蛋白的降解，并保護包裹的藥品。當在血液中循環(huán)時，這些DOP-DEDA-LNP載體在其疏水性脂質(zhì)區(qū)域與載脂蛋白（如apoE3）結(jié)合，從而增進癌細胞通過網(wǎng)格蛋白和小窩介導的內(nèi)吞途徑攝取它們。在內(nèi)溶酶體中，pH值較低，這造成DOP-DEDA脂質(zhì)納米粒帶正電荷，以增強靶細胞中的細胞溶質(zhì)滲入（圖3）。這些含有pH依賴性電荷轉(zhuǎn)化特性的LNP被認為是誘導RNAi介導的基因沉默的安全有效載體。LNPs效力的另一種重要決定因素是脂質(zhì)pKa。一系列研究表明，pKa為6.4是最大化siRNALNPs轉(zhuǎn)染的最佳選擇。根據(jù)mRNA的狀況，這種最佳pKa也發(fā)生了變化，最佳范疇為6.6~6.8。圖3pH對質(zhì)子化的應用及用于包載siRNA的電荷轉(zhuǎn)換脂質(zhì)體納米粒的構造作為一種提高靶向能力的方略，聚乙二醇化的脂質(zhì)的納米顆粒獲得了極大的研究愛好，其能夠減少血液中顆粒的去除，從而增加其在靶向組織器官的滯留和吸取。Moghimi的研究表明，與裸脂質(zhì)體相比，PEG修飾陰離子脂質(zhì)體能夠在皮下給藥部位獲得更加好的去除率和在淋巴結(jié)中更高的保存率。就PEG長度而言，與較長的PEG修飾脂質(zhì)體相比，較短的PEG鏈獲得較低的去除率，但在淋巴結(jié)中的保存率較高。在構造方面，有報道表明，使用線性或支化PEG鏈能夠明顯決定LNP的靶向行為和轉(zhuǎn)染能力。Truong課題組用吐溫80、吐溫20和1,，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）制備的脂質(zhì)體包載pDNA，并研究其靶向性、穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染程度。與DSPE-PEG的線性構造相比，Tween20和Tween80這兩種非離子表面活性劑均由含有類似支化PEG構造的飽和碳尾制成（圖4）。盡管存在這些構造差別，LNP在3周內(nèi)體現(xiàn)出類似的穩(wěn)定性。體內(nèi)轉(zhuǎn)染研究表明，含有較短的PEG的吐溫20的顆粒能夠更有效地靶向淋巴結(jié)。另首先，含有較長的PEG的吐溫80形成靶向脾臟的LNP，但效率較低。帶有線性DSPE-PEG的LNP重要在注射部位顯示出局部轉(zhuǎn)染。總之，這項研究表明，用支化PEG對LNP進行聚乙二醇化是一種可行的辦法，可選擇性地有效轉(zhuǎn)染靶器官。據(jù)推測，除了分子量和構造外，顆粒上的PEG密度也是一種重要因素。在三種類型的LNP中，帶正電的脂質(zhì)納米粒的聚乙二醇化與裸納米粒相比有很大差別。聚乙二醇化可避免帶正電的脂質(zhì)納米粒在給藥部位的高滯留。即使聚乙二醇化已被證明有助于避免顆粒從體循環(huán)中過早去除，但抗聚乙二醇抗體的產(chǎn)生已成為有害的共側(cè)損傷。近來，人們致力于采用品有生物相容性的聚合物的替代方略，以避免在第一次給藥后產(chǎn)生抗PEG抗體，否則會造成治療效果喪失，并可能對后續(xù)劑量產(chǎn)生不利影響。同時，Chen等人發(fā)現(xiàn)，在脂質(zhì)納米粒中加入4mol%地塞米松能夠克制注射后的免疫反映和抗體產(chǎn)生，這可能有助于開發(fā)聚乙二醇化脂質(zhì)納米粒載體。除了依賴于長時間循環(huán)和細胞被動攝取納米顆粒外，制劑科學家已經(jīng)認識到，通過將受體配體結(jié)合到顆粒表面，能夠增強對靶細胞的攝取。用靶向配體修飾脂質(zhì)納米粒是有效地將給藥系統(tǒng)靶向淋巴結(jié)或其它所需組織細胞的核心方略。例如，Vu等人使用血凝素抗原（HA）將脂質(zhì)體表面功效化，以提高抗體產(chǎn)生效率。這項工作表明HA功效化脂質(zhì)體能夠穿過淋巴結(jié)中的屏障細胞，增強生發(fā)中心的形成和卵泡輔助性T細胞免疫。通過共價鍵極愛那個單克隆抗體（MAB）結(jié)合到納米顆粒表面，進而靶向白細胞，也是一種有但愿的途徑。Veiga等人將抗Ly6C抗體與載有siRNA的脂質(zhì)納米粒結(jié)合，形成ASSET平臺（錨定二級單鏈抗體，實現(xiàn)靶向性）。如其它研究所示，該制劑能夠在體內(nèi)選擇性地靶向炎癥白細胞。同樣，實體瘤的p32體現(xiàn)水平普通高于非癌組織。為了運用這一點，已經(jīng)開發(fā)出linTT1（AKRGARSTA）和LyP-1肽，它們能夠以強親和力與p32結(jié)合。因此，這些肽被用作腫瘤歸巢的靶向配體。事實上，亨特等人將linTT1用作腹膜癌病的靶向配體，發(fā)現(xiàn)這些納米顆粒在小鼠腹膜腫瘤中的吸取程度比非靶向顆粒更大。Slik等人在體內(nèi)