中國(guó)藥典附錄XIIE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

中國(guó)藥典附錄XIIE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法本法系運(yùn)用鱟試劑來檢測(cè)或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量與否符合規(guī)定的一種辦法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查涉及兩種辦法，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者涉及濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種辦法進(jìn)行實(shí)驗(yàn).當(dāng)測(cè)定成果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法成果為準(zhǔn).本實(shí)驗(yàn)操作過程應(yīng)避免微生物和內(nèi)毒素的污染。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表達(dá)，1EU與1個(gè)內(nèi)毒素國(guó)際單位（IU）相稱。細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)標(biāo)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑敏捷度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作原則品的效價(jià)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作原則品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)標(biāo)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于實(shí)驗(yàn)中的賞試劑敏捷度復(fù)核、干擾實(shí)驗(yàn)及多個(gè)陽性對(duì)照。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量不大于0。O15EU／ml（用于凝膠法）或0。005EU/ml（用于光度側(cè)定法)且對(duì)內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)無干擾作用的滅菌注射用水。實(shí)驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)解決，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素.耐熱器皿慣用干熱滅菌法（250℃、30分鐘以上)去除，也可采用其它確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜辦法。若使用塑料器械,如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對(duì)實(shí)驗(yàn)無干擾的器械。供試品溶液的制備

某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。普通規(guī)定供試品溶液的pH值在6。0～8。0的范疇內(nèi)。對(duì)于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液)的pH值,可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必須通過驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子.內(nèi)毒素限值的擬定

藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L）普通按下列公式擬定：

L=K/M式中

L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，普通以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表達(dá)；K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表達(dá)，注射劑K=5EU/（kg?h），放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kg·h）,鞘內(nèi)用注射劑K=0。2EU/（kg·h）;M為人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/（kg·h)、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表達(dá)，人均體重按60kg計(jì)算，人體表面積按1。62m2計(jì)算.注射時(shí)間若局限性1小時(shí),按1小時(shí)計(jì)算.供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每公斤體重劑量（M）。按人用劑量計(jì)算限值時(shí),如遇特殊狀況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際狀況做必要調(diào)節(jié)，但需闡明理由。擬定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）

最大有效稀釋倍數(shù)是指在實(shí)驗(yàn)中供試品溶液被允許達(dá)成稀釋的最大倍數(shù)(1→MVD)，在不超出此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。用下列公式來擬定MVD:MVD=cL/λ式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表達(dá)時(shí),則c等于1。0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表達(dá)時(shí),c的單位需為mg/ml或U/ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，可計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L;λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示敏捷度〔EU/ml)，或是在光度測(cè)定法中所使用的原則曲線上最低的內(nèi)毒素濃度.

辦法1凝膠法凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反映的原理來檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的辦法。鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)

在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示敏捷度,用EU/ml表達(dá).當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或?qū)嶒?yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢查成果的變化時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)。根據(jù)賞試劑敏捷度的標(biāo)示值（λ),將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)標(biāo)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作原則品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦棍合器上混勻15分鐘，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素原則溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的10mm×75mm試管或復(fù)溶后的0。1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓶18支，其中16管分別加入0。1ml不同濃度的內(nèi)毒素原則溶液,每一種內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管加人0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口,垂直放人37℃士1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)l80°,若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性成果。當(dāng)最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0。25λ管均為陰性,陰性對(duì)照管為陰性，實(shí)驗(yàn)方為有效．按下式計(jì)算反映終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑敏捷度的測(cè)定值(λc）.λc＝antilg（∑X/4)式中

X為反映終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg）.反映終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一種呈陽性成果的濃度。

當(dāng)λc在0.5λ～2λ(涉及0。5λ～2λ）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示敏捷度λ為該批鱟試劑的敏捷度。

干擾實(shí)驗(yàn)

按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢查出內(nèi)毒素且不超出最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下操作。

表l凝膠法干擾實(shí)驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液———--—2B2λ/供試品溶液供試品溶液12λ421λ440。5λ480.25λ4C2λ/檢查用水檢查用水12λ421λ440.5λ480。25λ4D無/檢查用水-———-—2注:A為供試品溶液；B為干擾試劑系列；C鱟試劑標(biāo)示敏捷度的對(duì)照系列；D為陰性對(duì)照。只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的全部平行管都為陰性,并且系列溶液C的成果在鱟試劑敏捷度復(fù)核范疇內(nèi)時(shí),實(shí)驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算系列溶液C和B的反映終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和Et）:Es=antilg（∑Xs/4）Et=antilg（∑Xt：/4)式中XsXt分別為系列溶液C和溶液B的反映終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。當(dāng)Es在0。5λ～2λ（涉及0.5λ和2λ）及Et在0.5Es～2Es(涉及0。5Es和2Es)時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在不大于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)實(shí)驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超出MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾實(shí)驗(yàn)?？赏ㄟ^對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過其它適宜的辦法(如過濾、中和、透析或加熱解決等)排除干擾.為確保所選擇的解決辦法能有效地排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了原則內(nèi)毒素再通過解決的供試品溶液進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)前,或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝變化或?qū)嶒?yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響實(shí)驗(yàn)成果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。檢查法(l）凝膠程度實(shí)驗(yàn)

按表2制備溶液A、B、C和D.使用稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下操作。表2凝膠程度實(shí)驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度／被加入內(nèi)毒家的溶液平行管數(shù)A無／供試品溶液2B2λ／供試品溶液2C2λ／檢查用水2D無／檢查用水2注:A為供試品溶液；B為供試品陽性對(duì)照；C為陽性對(duì)照；D為陰性對(duì)照。成果判斷

保溫60分鐘±2分鐘后觀察成果.若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液B的平行管均為陽性，陽性對(duì)照溶液C的平行管均為陽性，實(shí)驗(yàn)有效.

若溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，鑒定供試品符合規(guī)定;若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽性，鑒定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)，溶液A需做4支平行管，若全部平行管均為陰性,鑒定供試品符合規(guī)定;否則鑒定供試品不符合規(guī)定。（2）凝膠半定量實(shí)驗(yàn)

本辦法系通過擬定反映終點(diǎn)濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量.按表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下操作。成果判斷

若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反映終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0。5λ～2λ之間，實(shí)驗(yàn)有效。

系列溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ，為每個(gè)系列的反映終點(diǎn)濃度,全部平行管反映終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度[按公式cE=antilg（∑X/2）]。如果檢查時(shí)采用的是供試品的稀釋液,則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將成果乘以稀釋倍數(shù).

如實(shí)驗(yàn)中供試品溶液的全部平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度不大于λ(如果檢查的是稀釋過的供試品，則記為不大于λ乘以供試品進(jìn)行半定量實(shí)驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)）。如果供試品溶液的全部平行管均為陽性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度不不大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。

若內(nèi)毒素濃度不大于規(guī)定的限值，鑒定供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度不不大于或等于規(guī)定的限值，鑒定供試品不符合規(guī)定。表3凝膠半定量實(shí)驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水1——22——24——28——2B2λ/供試品溶液12λ2C2λ/檢查用水檢查用水12λ221λ240。5λ280。25λ2D無/檢查用水———-—-2注：A為不超出MVD并且通過干擾實(shí)驗(yàn)的供試品溶液。從通過干擾實(shí)驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超出MVD。B為2λ濃度原則內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽性對(duì)照)。C為鱟試劑標(biāo)示敏捷度的對(duì)照系列。D為陰性對(duì)照。

辦法2光度測(cè)定法光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法系運(yùn)用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反映過程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的辦法。根據(jù)檢測(cè)原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法.終點(diǎn)濁度法是根據(jù)反映混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度或透光率）之間存在著量化關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的辦法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反映混合物的濁度達(dá)成某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反映時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的辦法。顯色基質(zhì)法系運(yùn)用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反映過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的辦法。根據(jù)檢測(cè)原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是根據(jù)反映混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的辦法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反映混合物的色度達(dá)成某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反映時(shí)間，或檢測(cè)色度增加速度的辦法。光度測(cè)定實(shí)驗(yàn)需在特定的儀器中進(jìn)行，溫度普通為37℃±1℃.供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時(shí)間等，參考所用儀器和試劑的有關(guān)闡明進(jìn)行。為確保濁度和顯色實(shí)驗(yàn)的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行原則曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)以及供試品的干擾實(shí)驗(yàn).原則曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)

當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或?qū)嶒?yàn)條件有任何可能會(huì)影響檢查成果的變化時(shí)，需進(jìn)行原則曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)。用原則內(nèi)毒素制成溶液,制成最少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得不不大于10）,最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限.每一稀釋環(huán)節(jié)的混勻時(shí)間同凝膠法，每一濃度最少做3支平行管。同時(shí)規(guī)定做2支陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照的反映時(shí)間不不大于原則曲線最低濃度的反映時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，原則曲線的有關(guān)系數(shù)（r）的絕對(duì)值應(yīng)不不大于或等于0。980,實(shí)驗(yàn)方為有效。否則須重新實(shí)驗(yàn).干擾實(shí)驗(yàn)

選擇原則曲線中點(diǎn)或一種靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為λm），作為供試品干擾實(shí)驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度.按表4制備溶液A、B、C和D。

表4光度測(cè)定法干擾實(shí)驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液最少2B原則曲線的中點(diǎn)（或附近點(diǎn)）的濃度（設(shè)為λm）供試品溶液最少2C最少3個(gè)濃度（最低一點(diǎn)設(shè)定為λ)檢查用水每一濃度最少2D無檢查用水最少2注：A為稀釋倍數(shù)不超出MVD的供試品溶液。B為加人了原則曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一種已知濃度內(nèi)毒素的，且與溶液A有相似稀釋倍數(shù)的供試品溶液。C為如“原則曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)”項(xiàng)下描述的，用于制備原則曲線的原則內(nèi)毒素溶液。D為陰性對(duì)照。按所得線性回歸方程分別計(jì)算出供試品溶液和含原則內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒紊含量ct和cs,再按下式計(jì)算該實(shí)驗(yàn)條件下的回收率(R）。R=(cs-ct）×100％當(dāng)內(nèi)毒素的同收率在50％-200％之間，則認(rèn)為在此實(shí)驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用.當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定的范疇內(nèi)，須按“凝膠法干擾實(shí)驗(yàn)”中的辦法去除干擾因素，并重復(fù)干擾實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證解決的有效性。當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、處方、生產(chǎn)工藝變化或?qū)嶒?yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響實(shí)驗(yàn)成果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn).檢查法

按“光度測(cè)定法的干擾實(shí)驗(yàn)”中的操作環(huán)節(jié)進(jìn)行檢測(cè)。

使用系列溶液C生成的原則曲線來計(jì)算溶液A的每