熱乙醇萃取法測定浮游植物葉綠素a的研究進展

熱乙醇萃取法測定浮游植物葉綠素a的研究進展

水生生態(tài)系統(tǒng)研究的一個重要指標是浮游植物的集體生物量（ph）。浮游植物的藍色信號含量通常用于快速估計組生物量。因此，浮游植物葉片含量的測定是浮游生物生物量的一個重要指標，并被廣泛應用。浮游植物葉綠素a的測定方法有許多種,根據(jù)所使用的儀器可以分為高效液相色譜法(HPLC法)、熒光光度計法和分光光度計法等.高效液相色譜法能夠很精確地測定各種光合色素的含量,但由于儀器昂貴,分析操作步驟繁瑣,一般不能用于野外大量樣品的快速分析.熒光光度計也能夠精確地測定葉綠素a的含量,特別是能夠測定葉綠素含量較低的樣品,但由于分析過程中容易受其他色素或色素衍生物的干擾,也不利于快速分析各類不同的野外樣品.因此,分光光度計法成為最常用的浮游植物葉綠素a的測定方法.在所有分光光度計法中,根據(jù)所用的色素萃取液分為了丙酮法、甲醇法和乙醇法等,再根據(jù)比色所用的波長,又分為單色法和多色法(例如單色丙酮法和四色丙酮法)等.自從Strickland和Parsons首先用90%丙酮作為萃取劑分析浮游植物葉綠素a含量以來,有大量的研究進行針對性的方法改進.盡管丙酮現(xiàn)在仍廣泛用于實際分析中,但由于丙酮的萃取效率比較差,特別是對藍藻的葉綠素a的萃取效率比較低,使得甲醇和乙醇成為替代丙酮的色素萃取劑.不過,甲醇對人體毒害性大,且在酸化過程中容易產(chǎn)生誤差,于是,乙醇成為現(xiàn)在廣泛應用的葉綠素a萃取劑.Jespersen和Chritoffersen較系統(tǒng)地比較了乙醇,甲醇和丙酮作為葉綠素萃取液的優(yōu)缺點,特別是比較了用乙醇作為萃取劑在不同濃度梯度(96%-83.5%),不同的萃取時間(6-24h)以及不同的萃取溫度(20℃和70℃)下的萃取效率,為熱乙醇萃取法的推廣應用提供了較好的理論基礎(chǔ).近30年來,由于中國水環(huán)境的惡化,特別是水體富營養(yǎng)化的問題,使得浮游植物葉綠素a的測定被廣泛地應用.但各研究單位所用的測定方法不盡相同,使數(shù)據(jù)的精確性和可比性受到影響.王建和王驥最先向國內(nèi)介紹了丙酮分光光度法測定浮游植物葉綠素a,使丙酮法成為國內(nèi)應用最廣泛的葉綠素a測定方法.陳宇煒和高錫云比較了丙酮法和乙醇法的差異,初次介紹了熱乙醇萃取法.本文就是在此基礎(chǔ)上,詳細介紹了浮游植物葉綠素a測定的熱乙醇萃取分光光度法的操作步驟,并根據(jù)多年的實踐和文獻的記載,提出一些常見實驗誤差的種類并探討了避免誤差的辦法.期望熱乙醇萃取法能夠盡快為國內(nèi)進行水環(huán)境研究的同行所采用,以便提高浮游植物葉綠素a測定的精確性和數(shù)據(jù)的可比性.1材料和方法1.1萃取樣品的制備過濾一定體積(V樣品)的水樣(根據(jù)樣品中葉綠素含量決定,一般富營養(yǎng)化水體需要250ml,貧營養(yǎng)水體需要1000-2000ml),將濾膜向內(nèi)對折,放入5ml的離心管,保存在零下20℃的冰柜(或冰箱的冷凍室)中.為保證樣品完全冷凍,至少一晝夜后才能萃取測定.此冷凍樣品最長保存3個月.1.2纖維材料濾膜抽濾設備(低壓真空泵)、抽濾器(47mm不銹鋼或有機玻璃抽濾器)、濾膜(直徑47mmWhatmanGF/C或GF/F47mm玻璃纖維濾膜(最佳),或國產(chǎn)0.45微米孔徑混合纖維濾膜;直徑25mmWhatmanGF/F玻璃纖維濾膜)、可調(diào)節(jié)控溫水浴鍋、90%乙醇、721型分光光度計(或同類產(chǎn)品).1.3樣品溶液的制備取250ml玻璃三角瓶裝適量90%乙醇在控溫水浴鍋中預熱,水浴溫度80-85℃(每個樣品需要約12ml乙醇);取出樣品,立即加入4ml左右熱乙醇,水浴2min.再將萃取的樣品放到室溫下避光處,樣品萃取4-6h,最長不超過12h.萃取結(jié)束后,用25mm玻璃纖維濾膜過濾萃取液并定容至10ml.1.4鹽酸的抗氧化酶系統(tǒng)上述10ml葉綠素樣品萃取液在分光光度計上用90%乙醇作為參比液進行比色,先在665nm波長測消光率E665,再在750nm波長測消光率E750.然后在樣品比色皿中加1滴1mol/L鹽酸進行酸化,加蓋搖勻,1min后重新在665nm波長測消光率A665,再在750nm波長測消光率A750.1.5葉綠素a含量的檢測Chla=27.9V乙醇[(E665-E730)-(A665-A750)]/V樣品其中,Chla指葉綠素a濃度(mg/m3).V乙醇是萃取液定容的體積(ml);V樣品是過濾水樣的體積(L).2結(jié)果和討論2.1取液尊重受試對象水樣過濾時,要避免在陽光直射處、高溫環(huán)境或接觸酸性物質(zhì);避免用過高的真空壓力(最好低于0.3個大氣壓),以免樣品細胞被破壞或穿過濾膜流失.過濾后要立即冷凍保存,避免與酸性物質(zhì)一起冷凍保存.在熱乙醇萃取時要防止過熱液體暴沸沖出離心管(一般情況下乙醇的沸點在81℃).此外,所有器具要避免酸污染.熱萃取后的4-6h常溫萃取一定要在黑暗中,時間不能超過12h.比色時,酸化在比色皿中進行,鹽酸的量不能多(1滴),否則會因為沖稀萃取液而導致測定誤差.2.2適當增加葉綠素體積E750和A750的讀數(shù)大于0.02,表明萃取液25mm過濾出問題,濾液太渾濁,需要重新過濾;若讀數(shù)小于0.01,表明萃取液中葉綠素濃度過低,在樣品過濾時要適當增加體積;讀數(shù)大于0.50,則表明葉綠素濃度過高,過濾時要適當減少體積.(E665-E750)/(A665-A750)的比值大于1.7,表明萃取液酸化不夠,可能鹽酸失效,需重新配制,重新測定.對于一般的富營養(yǎng)化水體,葉綠素a濃度應該在10-100mg/m3范圍內(nèi),如果超出這個范圍,特別是數(shù)量級上的差異,要檢查各步驟,是否有誤操作或誤計算.2.3實驗設計和過程由于浮游植物葉綠素a的測定步驟較多,造成人為誤差的機會就很大.葉綠素a又是對光、酸性物質(zhì)和溫度比較敏感,在操作過程中特別要避免這些因素的影響.建議在正式測定前做預實驗,平行測定5-10個相同的樣品,看誤差范圍.采樣過程中也要相應采平行樣,避免因操作不熟練而導致無法重復測定.表1列舉了操作過程中可能產(chǎn)生的誤差和防止誤差產(chǎn)生的處理方法