卷柏屬藥用植物鑒別及親緣關(guān)系分析

卷柏屬藥用植物鑒別及親緣關(guān)系分析

柏樹屬植物屬于蕨類植物門石松科。這是一種多年生草本植物。在世界上大約有700種。在中國，分布了60-70多個地區(qū)，其中22種具有藥用價值。現(xiàn)代藥理研究表明:卷柏屬藥用植物不僅具有傳統(tǒng)的清熱解毒作用,還具有抗腫瘤、降血糖、抗病毒、止血、免疫調(diào)節(jié)等多種功能。由于該屬某些植物的形態(tài)較為類似,鑒別時容易引起混淆。近年來分子標(biāo)記技術(shù)被引入中藥鑒定研究,以與形態(tài)組織學(xué)和化學(xué)分析方法得到的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。其中RAPD分析是一種有效的DNA分子標(biāo)記方法,對親緣關(guān)系分析有良好效果。因此,本文在用形態(tài)、組織和化學(xué)方法進(jìn)行鑒定研究的基礎(chǔ)上,對8種卷柏屬藥用植物進(jìn)行分子標(biāo)記研究,探索彼此間的親緣關(guān)系和遺傳距離,了解其變異程度,為卷柏屬藥用植物的鑒定和資源合理開發(fā)提供參考依據(jù)。1材料和試劑1.1新鮮葉片的采集和干燥實(shí)驗(yàn)材料樣品的采集地點(diǎn)和時間見表1,每份樣品采集6~10株植物的新鮮葉片,用硅膠快速干燥保存。樣品的植物學(xué)名由萬定榮教授鑒定,采集的標(biāo)本留存于湖北中醫(yī)學(xué)院標(biāo)本室。1.2pcr擴(kuò)增檢測儀器:TGL-16G型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠):DYY-6B型電泳儀(北京市六一儀器廠):GENEAMP5700PCR擴(kuò)增儀(APPLIEDBIOSYSTEMS,美國);MGIAS-1000D多媒體凝膠成像分析系統(tǒng)。試劑:瓊脂糖(Promega公司);SYBR-Greenl(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司);隨機(jī)擴(kuò)增引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、Marker(100bp-3000bp)、CTAB(上海Sangon公司);Tris(Amresco)。2方法和結(jié)果2.1相關(guān)乙醇的提取取干葉片約50mg,置1.5mlEp管中,加入液氮研碎,立即加入500μl預(yù)熱至56℃的2×CTAB提取緩沖液[CTAB2%,Tris-HCl(pH8.0)100mmol/L,EDTA20mmol/L,NaCl1.4mol/L,巰基乙醇2%]及巰基乙醇20μl混勻,56℃水浴保溫30min,其間輕微翻動浮板三次;加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)抽提,輕輕顛倒混勻,12000r/min離心10min,吸取上清液,加入0.1倍的10%CTAB溶液,室溫下放置10min,再用氯仿-異戊醇(24∶1)抽提一次;取上清液加入等體積的1×CTAB沉淀緩沖液[CTAB1%,Tris-HCl(pH8.0)50mmol/L,EDTA10mmol/L,巰基乙醇1%],室溫下放置3h;12000r/min離心30min,小心去掉上清液,分別用65%乙醇和85%乙醇各洗滌2次,然后于60℃烘箱中干燥30min。加入TE緩沖液溶解DNA,存于-20℃冰箱備用。2.2pcr檢測dntp、taq酶、dna模板反應(yīng)體系:總體積為25μl,其中10×PCRbuffer2.5μl,Mg2+(20mmol/L)1.9μl,引物(20μmol/μL)1μl,dNTP(10mmol/L)0.5μl,Taq酶(5U/μl)0.3μl,DNA模板(50ng/μl)0.5μl,ddH2O18.3μl。擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min,94℃變性45s,36℃退火1min,72℃延伸1.5min,40個循環(huán),72℃后延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物加入1%的熒光染料SYBER-Greenl于2%瓊脂糖凝膠上用1×TAE緩沖液電泳,在凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察并拍照。2.3強(qiáng)、重復(fù)性引物從60個10bp隨機(jī)引物中,篩選出擴(kuò)增性強(qiáng)、重復(fù)性好、多態(tài)性明顯的8個引物,用于全部卷柏屬樣品基因組DNA的擴(kuò)增。所用引物序列見表2。圖1、2為卷柏樣品的兩個擴(kuò)增圖譜。2.4相似系數(shù)的計(jì)算對每一個樣品根據(jù)在凝膠上同一位置所擴(kuò)增的DNA條帶的有或無分別標(biāo)記為1或0(條帶存在為1,條帶不存在為0),在相同條件下,遷移相同的條帶視為同源位點(diǎn),統(tǒng)計(jì)的二元數(shù)據(jù)用SPSS11.5分析軟件中的Jaccard方法計(jì)算樣品間的相似系數(shù),用Withingroupslinkage聚類方法分析,得到各樣品的親緣關(guān)系樹系圖(圖3)。8個引物共擴(kuò)增出58個條帶,見表2,擴(kuò)增產(chǎn)物多集中在100~1500bp。3討論3.1高鹽低ph值法提取方法的確定在提取總DNA時,比較了文獻(xiàn)介紹的CTAB法與高鹽低pH值法,發(fā)現(xiàn)CTAB法對新鮮樣品的提取效果優(yōu)于高鹽低pH值法。最終選擇了改良CTAB法,操作簡便,易于提取,擴(kuò)增條帶較清晰。在提取時,抽提液一般使用苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1),但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不用酚也能完全達(dá)到要求,含有酚的話反而會因其殘留問題影響后面的實(shí)驗(yàn)過程,故抽提液選擇為氯仿-異戊醇(24∶1)。3.2傳統(tǒng)分類方法分析聚類分析表明:8種卷柏屬植物有較明顯的分界,其中薄葉卷柏與疏葉卷柏,伏地卷柏與異穗卷柏,小翠云與翠云草兩兩之間的遺傳關(guān)系較近,分別聚為一類,這些分析結(jié)果具有一定合理性,其中最明顯的是小翠云與翠云草樣品的空間距離雖然最遠(yuǎn),但分析表明遺傳距離很近,聚為一類,與實(shí)際情況和傳統(tǒng)分類方法完全一致。細(xì)葉卷柏、江南卷柏與薄葉卷柏分別是三種具有顯著療效的藥用植物,它們的形態(tài)極為相似而易于混淆。其中,細(xì)葉卷柏多生于高海拔地區(qū),江南卷柏生于一般丘陵山坡,而薄葉卷柏多生于丘陵河谷或潮濕地區(qū)。分析結(jié)果表明,這三個種分別為較獨(dú)立的類群,它們之間既具有顯著的遺傳差異,但遺傳距離又比較接近,與實(shí)際情況相符。3.3遺傳聚類分析從實(shí)驗(yàn)結(jié)果及聚類分析圖可發(fā)現(xiàn),相同產(chǎn)地的同一種樣品的RAPD圖譜基本一致。同一產(chǎn)地(鶴峰卷柏,10、11號樣品)的疏葉卷柏首先聚類,然后與恩施產(chǎn)疏葉卷柏(12號樣品)聚類,再與產(chǎn)地相對較遠(yuǎn)的宜昌產(chǎn)疏葉卷柏(13號樣品)匯聚,說明疏葉卷柏樣品的地理分布越遠(yuǎn),其遺傳差距越明顯。在同種植物中,異穗卷柏和薄葉卷柏有2份樣品與主分類群出現(xiàn)了游離,正好反映了種下變異。其中樣品5為僅有獨(dú)立孢子枝的異穗卷柏,樣品4則為兼具營養(yǎng)枝和孢子枝的異穗卷柏(孢子葉尚未長出),盡管它們?yōu)橥粋€種,但并沒有簡單地聚為一類,提示兩者在所含遺傳信息上有所差異;樣品2和4聚為一類,樣品1和3在近距離另聚為一類,我們發(fā)現(xiàn)這些樣品在形態(tài)上就有所不同,樣品2和4孢子葉尚未長出,而樣品1和3有孢子枝。兩個薄葉卷柏樣品沒有完全聚為一類,也說明二者在遺傳基礎(chǔ)上有所差異,這一結(jié)果同樣支持將變異類型的薄葉卷柏作變種處理,與用形態(tài)學(xué)方法獲得的結(jié)果基本吻合。以上,本屬8種植物17份樣品的RAPD研究及聚類分析結(jié)果表明,RAPD技術(shù)能較好地用于分析卷柏屬植物種間或種下樣品的遺傳距離,能靈敏地揭示兩個關(guān)系相近的個體之間的遺傳差異,適合解決種下等級鑒定等問題。同時,由遺傳距離獲得的有關(guān)藥用植物間的親緣關(guān)