柴胡皂苷治療酒精性肝病大鼠的研究

柴胡皂苷治療酒精性肝病大鼠的研究

抑郁是人類身心健康的常見病。關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機制存在多種假說,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)假說是目前研究的熱點。本研究通過RT-PCR法檢測柴胡皂苷對抑郁大鼠腦內(nèi)BDNF水平的影響,分析其抗抑郁作用及可能的作用機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1儀器、檢測和分析梯度PCR儀(德國Biometra公司),7550型紫外分光光度計(上?；萜展?,DYY-Ⅲ4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、水平式電泳槽(北京六一儀器廠),低溫超速離心機(美國貝克曼公司),PP-200S型電子天平(上海華威電子儀器廠),紫外透射檢測儀(上海雙贏科學(xué)儀器廠),Kodak凝膠電泳呈像分析系統(tǒng)(EDAS),玻璃勻漿器、吸頭、EP管均為無RNA酶處理過的產(chǎn)品。1.1.2dna的純化、回收大鼠腦海馬組織、RT-PCR兩步法試劑盒、DNAMarkerDL2000、DNA快速純化/回收試劑盒、Trizol(日本Takara公司),焦碳酸二乙酯(DEPC)、溴化乙錠(美國Fluka公司)。1.1.3caagctgactagctagctagctagctagctagctciptagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagct科學(xué)科各自亞食酸caagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctgactagctagctagctciptac(1)特異引物由大連寶生物科技有限公司合成,引物設(shè)計根據(jù)Primer5.0設(shè)計軟件完成。見表1。(2)大鼠腦內(nèi)BDNFmRNA序列:atgaccatccttttccttactatggttatttcatacttcggttgcatgaaggctgcgccc;atgaaagaagcaaacgtccacggacaaggcaacttggcctacccagctgtgcggacccat;gggactctggagagcgtgaatgggcccagggcaggttcgagaggtctgacgacgacgtcc;ctggctgacacttttgagcacgtgatcgaagagctgctggatgaggaccagaaggttcgg;cccaacgaagaaaaccataaggacgcggacttgtacacttcccgggtgatgctcagcagt;caagtgcctttggagcctcctctgctctttctgctggaggaatacaaaaattacctggat;gccgcaaacatgtctatgagggttcggcgccactccgaccccgcccgccgtggggagctg;agcgtgtgtgacagtattagcgagtgggtcacagcggcagataaaaagactgcagtggac;atgtccggtgggacggtcacagtcctggagaaagtcccggtatcaaaaggccaactgaag;caatatttctacgagaccaagtgtaatcccatgggttacacgaaggaaggctgcaggggc;atagacaaaaggcactggaactcgcaatgccgaactacccaatcgtatgttcgggccctt;actatggatagcaaaaagagaattggctggcggttcataaggatagacacttcctgtgta;tgtacactgaccattaaaaggggaagatag。上游引物與BDNF序列的第182~202堿基完全一致,下游引物與BDNF序列的第690~710堿基完全互補。1.2方法1.2.1單籠飼養(yǎng)環(huán)境及多次給藥對慢性應(yīng)激的影響60只大鼠實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1w。隨機分為6組,每組10只,正常組:分兩籠群居飼養(yǎng),每籠5只,按照需要正常給予飼料及飲水,不接受任何刺激。抑郁組:參照文獻,加以改進后建立模型,實驗的56d內(nèi),該組大鼠均分別單籠喂養(yǎng),并接受各種不同的慢性應(yīng)激刺激,28d后每日給予生理鹽水1ml灌胃。氟西汀組、柴胡皂苷低劑量組(SsLDG)、柴胡皂苷中劑量組(SsMDG)、柴胡皂苷高劑量組(SsHDG)飼養(yǎng)環(huán)境及刺激方式同抑郁組,分別在28d后每日給予氟西汀10ml/kg、柴胡皂苷5ml/kg、柴胡皂苷10ml/kg、柴胡皂苷15ml/kg灌胃給藥,期間仍持續(xù)刺激。實驗結(jié)束,各組大鼠斷頭處死,冰上迅速剝離大腦,進行海馬的分離,將分離出的組織分別放入EP管中用液氮快速冷凍后,放入-80℃冰箱保存至測定。1.2.2細胞rt-pcr檢測海馬細胞的表達(1)Trizol法提取大鼠海馬組織BDNF總RNA:剪取組織約100mg置于預(yù)冷的玻璃勻漿器,加入適量的RNAisoPlus充分勻漿(盡量保持低溫),室溫放置5min,加入200μl氯仿,在渦旋振蕩器上劇烈振蕩15s,室溫放置5min,4℃12000r/min離心15min,將上清液小心移入另一離心管中,加入等體積異丙醇,充分混勻,室溫放置10min,4℃12000r/min離心10min,棄上清,沉淀中加入75%乙醇約1ml,靜置10min,4℃12000r/min離心5min,棄上清,倒置于濾紙上,室溫放置5~10min,使乙醇揮發(fā),20μlDEPC水溶解沉淀,-80℃凍存。(2)RNA的濃度測定及純度檢測:取1μl提取的RNA原液加199μl三蒸水,充分混勻,以三蒸水調(diào)零,紫外分光光度記測得各組腎臟RNA在280nm及260nm處的光吸收值,然后按下列公式計算RNA的濃度及純度。RNA的濃度計算公式:RNA(μg/ml)=40×OD260×稀釋倍數(shù)。RNA純度檢測標(biāo)準(zhǔn):OD260/OD280=1.8~2.0。定量后,取各組海馬組織的總RNA各1μl在1%瓊脂糖凝膠以90V電壓做穩(wěn)壓電泳,通過檢測18S及28SRNA的亮度比值也對所提取的腦海馬組織的總RNA做完整度的檢測。(3)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):(1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):按下列組成配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。MgCl22μl、10×RT緩沖液1μl、RNaseFreedH2O3.75μl、dNTP混合物(各10mmol/L)1μl、RNase抑制劑0.25μl、AMV反轉(zhuǎn)錄酶10.5μl、Random9mersOligodT-AdaptorPrimer0.5μl、實驗樣品RNA1μl。按照以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),30℃10min、48℃30min、99℃5min、5℃5min,1個循環(huán)。(2)PCR反應(yīng):按下列組成配置PCR反應(yīng)液。5×PCR緩沖液10μl、滅菌蒸餾水28.75μl、dNTP(10mmol/L)2μl、BDNF和β-actinF18的上、下游引物各0.5μl、mRNA模板1μl、TaKaRaExTaqHS0.25μl。把上述反應(yīng)液加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后的PCR反應(yīng)管中,輕輕混勻。按以下條件進行PCR反應(yīng):94℃2min;94℃30s,60℃30s,72℃60s,重復(fù)30個循環(huán);72℃10min。(4)RT-PCR產(chǎn)物的定量鑒定:取20μlPCR產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳,0.5%溴化乙錠染色20min。用Kodak凝膠EDAS進行電泳結(jié)果的拍照及電泳條帶的強度分析,分別計算每一條泳道的目的基因擴增產(chǎn)物與內(nèi)參β-actin擴增產(chǎn)物的強度比值,用來表示該目的基因的相對表達水平。1.3統(tǒng)計方法2結(jié)果2.1逆轉(zhuǎn)錄pcr所提取rna的核心部分各組大鼠腦組織總RNA提取后的電泳條帶顯示5S、18S、28S條帶清晰、完整,表明所提取的RNA完整無降解,可作為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。見圖1,表1。2.2正常組和正常組na的表達水平比較各組大鼠BDNFmRNA的RT-PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察可見位置大概在509bp,與理論設(shè)計相符。抑郁組大鼠腦中BDNFmRNA的相對表達量(0.476±0.060)與正常組(1.082±0.035)相比,表達顯著下調(diào)(P<0.01);正常組與柴胡皂苷中(0.969±0.045)、高劑量組(0.994±0.033)、氟西汀組(1.137±0.048)相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),柴胡皂苷低劑量組BDNFmRNA的相對表達量(0.584±0.046)有高于抑郁組的趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。3抑郁癥大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)疫情防控現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于抑郁癥發(fā)病機制的研究假說很多,目前最新的一種假說是抑郁癥患者的神經(jīng)元營養(yǎng)因子缺乏。在神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中,以BDNF最具代表性。它是一種分布廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子,主要分布在海馬、杏仁核、紋狀體和皮質(zhì),其中尤以海馬含量最高。海馬與抑郁癥關(guān)系密切,因此研究抑郁狀態(tài)下海馬BDNF的變化有著重要的意義。BDNF主要產(chǎn)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元,它是5-羥色胺能神經(jīng)元的生長因子,對5-羥色胺能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元等多種神經(jīng)元具有營養(yǎng)、保護、支持作用。抑郁癥的神經(jīng)營養(yǎng)學(xué)說認(rèn)為,大腦BDNF水平降低易導(dǎo)致抑郁的發(fā)生,BDNF的下調(diào)可增加海馬神經(jīng)元對傷害性應(yīng)激的敏感性,間接引起神經(jīng)毒性,導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的萎縮甚至死亡;通過各種方法升高大腦BDNF的水平可能產(chǎn)生抗抑郁效果。本研究提示抑郁癥大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)BDNF表達明顯降低,這與此前的神經(jīng)營養(yǎng)假說結(jié)果一致。有研究報道了BDNF在抗抑郁藥治療機制中的作用,發(fā)現(xiàn)很多抗抑郁藥均能提高大鼠腦內(nèi)不同區(qū)域BDNFmRNA水平,包括單胺氧化酶抑制劑、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SS-RI)、三環(huán)類抗抑郁藥和去甲腎上腺素再攝取抑制劑(NA-RI)。雖然BDNF上調(diào)機制尚未完全清楚,但有研究報道NARI和SSRI類抗抑郁藥能提高大鼠海馬cAMP反應(yīng)結(jié)合蛋白(CREB)的水平,而CREB正是調(diào)節(jié)BDNF的細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子。國外尸檢研究報道,對抑郁癥患者自殺死后的腦組織標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)BDNF和TrkB在海馬的表達減少,而在死前進行過抗抑郁治療的患者的海馬