幾種誘導(dǎo)抗菌肽的方法及其抑菌活性研究

幾種誘導(dǎo)抗菌肽的方法及其抑菌活性研究

昆蟲是自然界中最大的生物群體。它們對環(huán)境的高度適應(yīng)性和周圍環(huán)境的脆弱性來自該國的高效網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。各種昆蟲雖在適應(yīng)環(huán)境上各有其獨特的方式,然而在抵御外物侵染時卻有很相似的地方,即都能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來保護自己。自從1962年Stephens等發(fā)現(xiàn)大蠟螟(Galleriamellonella)幼蟲血淋巴中具有一種殺綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的免疫因子起,迄今為止,已從昆蟲中分離出如凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白及抗菌肽等百余種抗菌物質(zhì)。已有試驗表明抗菌肽不僅具有廣譜的抗人體致病細菌的能力,而且具有抗真菌、病毒、原蟲和錐蟲的活性,對多種癌細胞及動物實體瘤也有明顯的殺傷作用,有可能成為抗生素的新來源。目前關(guān)于抗菌肽的研究多集中在種類的篩選、性質(zhì)的鑒定及通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對其進行開發(fā)利用等方面。研究表明,多種昆蟲在微生物、化學(xué)物質(zhì)、不良環(huán)境條件等刺激下均可產(chǎn)生抗菌肽,抗菌物質(zhì)的活性因誘導(dǎo)方法和昆蟲種類的不同存在很大差異;高活性抗菌肽的獲得,是研究抗菌肽的基礎(chǔ),優(yōu)化其制備技術(shù)對抗菌肽進一步的研究具有重要意義。因此,本試驗利用鱗翅目甜菜夜蛾和鞘翅目黃粉蟲作為試驗材料,探索不同誘導(dǎo)方式和處理方式對抗菌肽活性影響,以期得到高活性抗菌肽制備方法,其結(jié)果將對抗菌肽的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。1材料和方法1.1幼蟲與大腸桿菌黃粉蟲(Tenebriomolitor)和甜菜夜蛾(SpodopteraexiguaHuber)幼蟲由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植保院昆蟲實驗室飼養(yǎng)提供;大腸桿菌(Escherichiacoli)由河北省疾病預(yù)防控制中心提供;金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動科院提供。1.2抗酶誘導(dǎo)方法1.2.1黃粉蟲和甜夜蛛幼蟲的感染誘導(dǎo)取于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌,12000r/min,4℃離心5min,收集菌體。取5齡若蟲,用昆蟲針蘸取收集的大腸桿菌,針刺黃粉蟲五齡和甜菜夜蛾四齡幼蟲的腹部,誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫防御反應(yīng),72h后收集存活的黃粉蟲和甜菜夜蛾幼蟲,以健康未處理試蟲為對照。冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2黃粉蟲和1-調(diào)節(jié)黃粉蟲和自適應(yīng)”四齡幼蟲體壁的制備用蘸有稀釋3000倍的高效氯氰菊酯溶液的四號昆蟲針刺黃粉蟲五齡和甜菜夜蛾四齡幼蟲體壁,24h后收集存活的黃粉蟲和甜菜夜蛾幼蟲,冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.3試蟲未處理試驗蟲的處理將試蟲放入直徑為18cm的大培養(yǎng)皿中,均勻攤開,用功率為50W的紫外光燈照射0.5h,飼喂在無菌養(yǎng)蟲盒內(nèi),盒內(nèi)鋪無菌衛(wèi)生紙飼喂菜葉24h后,以健康未處理試蟲為對照。冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.4黃粉蟲幼蟲保肝試驗取齡期一致的黃粉蟲五齡幼蟲,饑餓1d后,飼喂含大腸桿菌的菜葉1d,72h后收集存活的黃粉蟲幼蟲,以健康未處理試蟲為對照。冰箱保存?zhèn)溆谩?.3收集兩國血淋巴采用毛細管提取昆蟲血淋巴,冰上操作:將蟲體用75%的酒精消毒后用無菌水沖洗,后用無菌濾紙吸干,剪去其一對足用毛細管收集其血淋巴。將血淋巴于4℃,12000r/min離心30min后,取上清,將上清液裝入分子截流量為2000U的透析袋內(nèi),于聚乙二醇中4℃透析,將透析濃縮的樣品再次在4℃,12000r/min離心30min,取上清4℃保存?zhèn)溆谩?.4乙酸銨絡(luò)合萃取對大腸桿菌抑菌活性的影響取濃度分別為1,2,3,4,5mol/L的乙酸銨與等體積抗菌肽溶液混合,室溫放置1h后檢測對大腸桿菌的抑菌活性,試驗設(shè)3個重復(fù),用同濃度未處理抗菌肽做對照。1.5抑菌活性測定用鹽酸和氨水配置pH值分別為3,5,7,9,11的溶液,這些溶液分別與等體積樣品液混合,室溫放置1h后,分別檢測對大腸桿菌的抑菌活性,試驗設(shè)3個重復(fù),以同濃度未處理抗菌肽為對照。1.6凍融次數(shù)對大腸桿菌抑菌活性的影響取450μL的樣品液,-20℃冷凍,室溫下解凍,凍融次數(shù)分別為1,2,3,4,5,6次,分別檢測對大腸桿菌的抑菌活性,試驗設(shè)3個重復(fù),以同濃度未經(jīng)凍融抗菌肽為對照。1.7抑菌圈直徑測定抑菌活性測定采用抑菌圈法。大腸桿菌和金黃葡萄球菌于37℃,220r/min振蕩培養(yǎng)16h,均勻涂板后,將滅菌濾紙片呈“品”字形放置其上,每點加30μL抗菌肽溶液,放置至完全浸入培養(yǎng)基后,置37℃的培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)24h后測定各處理抑菌圈直徑。比較抗菌肽活性差異。2結(jié)果與分析2.1不同方法處理的存活率試蟲經(jīng)誘導(dǎo)后較高的存活率是大量制備抗菌肽的基礎(chǔ),不同誘導(dǎo)方式處理試蟲存活情況見表1。不同誘導(dǎo)源處理試蟲存活率有明顯差異。黃粉蟲經(jīng)針刺蘸大腸桿菌法誘導(dǎo)的存活率最高,而用饑餓法處理的存活率最低,造成死亡的原因可能是,經(jīng)饑餓后,使黃粉蟲攝食大腸桿菌菌量較其他方式偏高,因而造成死亡率偏高的現(xiàn)象;甜菜夜蛾經(jīng)紫光燈照射法處理的存活率最高,而用針刺蘸高效氯氰菊酯法處理的存活率最低,造成死亡的原因可能和其體壁的厚度、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)有很大的關(guān)系。所以,不同的昆蟲在選擇誘導(dǎo)方法時應(yīng)結(jié)合誘導(dǎo)后的存活率及抑菌活性的大小,選擇其適宜的誘導(dǎo)方法。2.2不同誘導(dǎo)源對抗菌活性的影響2.2.1不同誘導(dǎo)源的抗菌肽幾種誘導(dǎo)方式得到的抗菌肽對大腸桿菌抑菌試驗結(jié)果見圖1。由圖中發(fā)現(xiàn),幾種誘導(dǎo)源均可誘導(dǎo)甜菜夜蛾和黃粉蟲產(chǎn)生抗菌肽,但抑菌活性有差異,其中甜菜夜蛾和黃粉蟲經(jīng)針刺蘸大腸桿菌法誘導(dǎo)的抗菌肽對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的抑菌活性最好。說明采用針刺蘸大腸桿菌法能得到高活性的抗菌肽。2.2.2針刺”可誘導(dǎo)高活性昆蟲的抑菌活性對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)抑菌試驗結(jié)果見圖2。經(jīng)檢測可知,甜菜夜蛾和黃粉蟲經(jīng)針刺蘸大腸桿菌法誘導(dǎo)的抗菌肽該菌的抑菌活性最好。說明2種昆蟲抗菌肽對革蘭氏陽性菌也有一定的抑菌作用。采用針刺蘸大腸桿菌法同樣可以得到高活性的抗菌肽。由表1,圖1,圖2結(jié)果可知,2種昆蟲利用針刺蘸大腸桿菌法進行抗菌肽的誘導(dǎo),均具有試蟲死亡率低,抗菌肽抑菌活性高,明顯好于針刺蘸高效氯氰菊酯,紫外燈照射法和饑餓法誘導(dǎo)抗菌肽。說明針刺蘸大腸桿菌法是幾種誘導(dǎo)方法中最佳的。2.3濃度對抑菌活性的影響抗菌肽經(jīng)不同濃度乙酸銨處理抑菌活性結(jié)果見圖3。乙酸銨濃度在0~2mol/L范圍內(nèi)抑菌活性好于對照組(0.93cm);當(dāng)濃度超過2mol/L時,活性開始呈現(xiàn)下降趨勢,當(dāng)濃度達到4mol/L時樣品的抑菌活性明顯降低。由此表明,乙酸銨的濃度和抗菌肽的抑菌活性有很大的關(guān)系,因此,在抗菌肽純化過程中,選擇適宜濃度乙酸銨作為洗脫液可以提高抗菌肽的活性。2.4h值溶液處理對抗菌活性的影響自然提取的黃粉蟲和甜菜夜蛾的抗菌肽的pH值約為7,近于中性,用不同pH值溶液處理抗菌肽抑菌試驗結(jié)果見圖4。在pH值5~9范圍內(nèi)活性差異不大,顯示抗菌肽具有較強的抗酸堿性能,但在pH<3和pH>11的環(huán)境下樣品的活性會受到很大的影響,由此表明,極端pH值是影響樣品活性的重要因素。2.5反復(fù)凍融法凍融試驗結(jié)果見圖5。凍融次數(shù)影響抗菌肽的抑菌活性,活性隨著凍融次數(shù)的增加而降低,因此,在試驗中,對同一樣品不宜反復(fù)凍融,小容量分裝是很好的措施。3血淋巴提取法對紫菜夜施的影響本試驗結(jié)果初步證明黃粉蟲和甜菜夜蛾抗菌肽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有一定的抑制活性,2種抗菌肽的抑菌活性與誘導(dǎo)方式、乙酸銨濃度、pH值、凍融次數(shù)等因素相關(guān)。試驗表明,不同誘導(dǎo)源的供試蟲存活率有明顯差異。黃粉蟲經(jīng)針刺蘸大腸桿菌法誘導(dǎo)的存活率最高,而用饑餓法處理的存活率最低,甜菜夜蛾經(jīng)紫光燈照射法處理的存活率最高,而用針刺蘸高效氯氰菊酯法處理的存活率最低,所以不同的昆蟲在選擇誘導(dǎo)源時應(yīng)結(jié)合誘導(dǎo)后的存活率及抑菌活性的大小,選擇最適宜的誘導(dǎo)方法。在本試驗中,由于甜菜夜蛾自殘習(xí)性,不能采用饑餓法進行誘導(dǎo)。在血淋巴提取方法上2種試蟲血淋巴提取采用直接提取法較好。蟲體誘導(dǎo)后冷凍處理的抑菌活性有所增強,乙酸銨濃度也影響抗菌肽的活性,1mol/L的乙酸銨可以一定程度上提高抗菌肽的抑菌活性;2種試蟲的抗菌肽pH約為7,