不同相對分子量的殼聚糖抑菌作用及機理研究

不同相對分子量的殼聚糖抑菌作用及機理研究

1979年，allan等人提出了殼聚糖的抗菌性，其抗菌性和抗菌機制一直是國內(nèi)外科學家的研究熱點，相關(guān)報告層出不窮。但對其抑菌機理尚無明確定論,而且對不同相對分子質(zhì)量殼聚糖的抑菌效果的研究也不完全一致。目前關(guān)于殼聚糖抑菌作用規(guī)律的研究較少,作為系統(tǒng)研究之一,本文采用體外抑菌法分別測定了六種不同相對分子量的殼聚糖對五種常見菌的抑菌活性,對殼聚糖的抑菌機理做了探討,以期為殼聚糖開發(fā)應(yīng)用提供科學依據(jù)。1實驗設(shè)備和材料1.1上海合作大學s2cjbu好氧生化技術(shù)中心LDZX40CI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海中安醫(yī)療器械廠);生化培養(yǎng)箱(國華電器);SNCJ1BU無菌操作臺(蘇凈集團安泰公司);DENSIMAT型細菌電比濁儀(法國生物梅里埃公司)。1.2實驗材料1.2.1降解制備d相對分子量100萬、80萬(浙江玉環(huán)縣殼聚糖有限公司,DD.98%);20萬、14萬、10萬、5萬(DD.95%,H2O2-HAc降解制備);脫乙酰度(DD.)87%、98%由分子量為50萬(DD.65%)的殼聚糖按文獻方法制得,DD.值測定采用酸堿滴定法。1.2.2供試菌種大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC35218),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC26113),變形桿菌(Proteusspecies,ATCC12453),白色念珠菌(Candidaalbicans,ATCC10231),綠膿桿菌(P.aeruginosa,ATCC27853)由天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗科提供。1.2.3牛肉浸膏ph的確定pH7.1;肉湯培養(yǎng)基(0.3gNaCl,1.0g蛋白胨,0.3g牛肉浸膏每100mL溶液),1mol/LNaOH調(diào)其pH=6.3。2實驗方法2.1皮聚糖室外感染實驗2.1.1細菌的激活受試菌種(標準菌株)接種于固體瓊脂培養(yǎng)基,37℃活化24h,金黃色葡萄球菌活化48h。2.1.2懸浮液的制備將活化后的受試菌種用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中,制成含菌數(shù)濁度約為0.5Mcf的菌懸液備用。2.1.3殼聚糖濃度對培養(yǎng)基的影響將直徑為6mm的圓形濾紙片放入各不同分子量、不同濃度的殼聚糖溶液中一同高壓蒸汽滅菌(120℃、0.12MPa)20min。取各菌懸液100μL均勻涂抹在培養(yǎng)基平皿表面,用無菌鑷子將各濾紙片貼在各種含菌平皿上,每皿貼7個,分別對應(yīng)于6種殼聚糖濃度及對照。實驗殼聚糖濃度設(shè)置分別為2%、1.5%、1.0%、0.5%、0.25%、0.125%。培養(yǎng)皿中間貼1%的醋酸為對照,對照樣除不加殼聚糖外,其他條件與加有殼聚糖的培養(yǎng)基一致。每種菌種重復3次試驗,在37℃下培養(yǎng)24h,測定圓濾紙片的抑菌圈直徑。2.2殼聚糖的最低抑制濃度測定取15mL融化的瓊脂培養(yǎng)基,加入等量不同分子量的殼聚糖-1%HAc溶液,使每個試管殼聚糖含量分別為0.025%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%,滅菌,冷卻后加入100μL約0.5Mcf的各被試菌菌懸液,涂布均勻后于37℃培養(yǎng)24h,觀察菌落生長情況,以不長菌的殼聚糖最低濃度為殼聚糖對各供試菌的最低抑制濃度。2.3殼聚糖的測定接種前先用顯微鏡活菌計數(shù)法測定每毫升菌液中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的含菌個數(shù),實驗中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別為1.0×106個/mL、2.5×106個/mL。用移液槍各移取500μL至不同脫乙酰度的殼聚糖溶液及肉湯培養(yǎng)基中,使溶液中殼聚糖含量為1.0%。每24h取樣,在血球板計數(shù)器上觀察讀數(shù),直到所有樣品和對照中的菌體數(shù)量基本不變化為止。繪制細菌的生長曲線和不同脫乙酰度殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌曲線。3結(jié)果與討論3.1殼聚糖的抑菌活性分析表1～5數(shù)據(jù)可以看出,殼聚糖分子量對其抑菌活性有很大的影響。對于各被試菌,殼聚糖分子量與其抑菌性能大小大致成曲線關(guān)系。其總體趨勢表現(xiàn)為低分子量的殼聚糖抑菌活性強于高分子量殼聚糖,尤其是對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和綠膿桿菌最為明顯。對于革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌,大分子量殼聚糖也表現(xiàn)出較好的抑菌活性,這是因為殼聚糖在溶液中呈無規(guī)則線團狀,隨著分子量的增加,其分子鏈的柔韌性和卷曲程度增加,同時端基減少,使得殼聚糖內(nèi)消毒因子-NH2含量也略有增多,二者均使其對細菌的吸附和絮凝能力增強;但分子量太大時,溶液的粘度增加,殼聚糖分子鏈的卷曲和纏結(jié)程度增加,使部分消毒因子-NH2被包埋在大分子的無規(guī)則團中,影響了其對細菌的吸附及與細菌的反應(yīng)能力,此時分子量較小的殼聚糖則發(fā)揮靈活運動的優(yōu)勢,減少了分子間氫鍵的形成,表現(xiàn)了較好的抑菌活性。另外,可能還與對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌不同的抑菌機理有關(guān)。3.2分子量殼聚糖抑菌圈直徑的確定從不同濃度的殼聚糖對各被試菌的抑菌圈直徑大小可以看出,無論是低分子量殼聚糖還是高分子量殼聚糖,隨著濃度的不斷增加,其抑菌圈直徑逐漸增大。原因歸結(jié)為殼聚糖中-NH2的存在,隨著殼聚糖濃度的不斷增加,溶液中-NH2的濃度也將增加,從而抑菌效果也增強。3.3脫乙酰度對殼聚糖抑菌性能的影響由圖1、2可看出,含殼聚糖樣品組的菌體的生長要比不含殼聚對照組慢,對照組在24～48h便可到達生長頂點(大腸桿菌菌體數(shù)量超過5.85×108個/mL、金黃色葡萄球菌4.8×108個/mL),而樣品組要在48～96h間才達到生長頂點,且隨著殼聚糖脫乙酰度(DD.)的增高,其對菌體生長的延緩作用時間也更長。隨著脫乙酰度的逐漸增大,殼聚糖的抑菌能力增強,說明脫乙酰度對殼聚糖的抑菌性能有影響。這是因為殼聚糖的脫乙?；?實際上是其分子鏈上親脂性基團–NHCOCH3逐漸被親水基團-NH2取代的過程。在酸性條件下,-NH2易與H+結(jié)合形成NH+3,隨著脫乙酰度的逐漸增大,NH+3增多,對于細菌(帶負電荷)的靜電引力增強,更多的細菌被絮凝、聚沉,其生長繁殖也隨之減慢。這也說明殼聚糖的抗菌活性與其-NH2有關(guān),-NH2是殼聚糖的消毒因子,與我們以前的研究結(jié)論相吻合。3.4革蘭氏菌抑制能力從表6可看出,殼聚糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的作用最為明顯,對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)的抑制能力強與革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌);低分子量殼聚糖對各被試菌的最低抑菌濃度較高分子量殼聚糖的低。3.5殼聚糖的抗菌作用目前,關(guān)于殼聚糖的抑菌機理尚無定論。本試驗結(jié)果表明,分子量是影響殼聚糖的抑菌、抗菌性能大小的最重要因素。無論是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌,低分子量的殼聚糖的抑菌作用均優(yōu)于高分子量的殼聚糖。低分子量殼聚糖有一定殺菌作用,是因為分子量越小,越容易進入細胞壁的空隙結(jié)構(gòu)內(nèi),干擾細胞的新陳代謝而達到殺菌目的。高分子量殼聚糖具有較強的抑菌、殺菌作用,其抗菌性能源于抗菌因子-NH+3,且高分子量殼聚糖具有很好的成膜特性,能在細胞表面形成足夠致密的膜以阻止細菌的營養(yǎng)輸入。之所以低分子量殼聚糖有較好的抗菌活性,是因為其即兼?zhèn)涑赡ぬ匦?又較高分子量殼聚糖易與進入細菌細胞中。另外,從我們長期的研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖的抑菌、抗菌作用還與被試菌種及其介質(zhì)環(huán)境等有關(guān)?？偟膩碚f,殼聚糖對革蘭氏陽性菌的抑制作用比革蘭氏氏陰性菌強。這可以從其細胞壁的組成來分析,革蘭氏陽性菌的細胞壁較厚(15～80nm),結(jié)構(gòu)緊密,且細胞壁含有豐富的磷壁酸使細胞壁形成一個負電荷環(huán)境,革蘭氏陰性菌細胞的壁薄(9～11nm),交聯(lián)松散。所以,高分子量殼聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌作用可能主要以成膜阻斷營養(yǎng)源為主,低分子量殼聚糖對大腸桿菌的抑菌作用主要以進入細菌細胞干擾其代謝為主。我們對水溶性殼聚糖、殼寡糖的抑菌性能已經(jīng)作了較為系統(tǒng)的研究,認為殼聚糖只有在酸性介質(zhì)中(pH<6.3)才能表現(xiàn)出較好的抑菌活性,其抑菌活性大小順序依次為殼聚糖、殼寡糖、水溶性殼聚糖,這可能與它們不同的作