卡托普利及氯沙坦對大鼠肺動脈高壓基質(zhì)金屬蛋白酶2、9及其組織抑制物imp-1的影響

卡托普利及氯沙坦對大鼠肺動脈高壓基質(zhì)金屬蛋白酶2、9及其組織抑制物imp-1的影響

血管重建是動脈高壓（pah）形成的顯著特點(diǎn)，包括細(xì)胞成分和外基質(zhì)（ecm）的重建。ECM的重構(gòu)包括膠原和彈性蛋白的沉積增加和轉(zhuǎn)換加快。不僅如此,ECM重構(gòu)還參與調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌(PASMC)的增殖和遷移?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是細(xì)胞外基質(zhì)一種與膠原降解有關(guān)的蛋白水解酶,在ECM、細(xì)胞遷移和生長的調(diào)節(jié)中起重要的作用;探討MMPs在肺血管重構(gòu)中的作用,有助于了解肺高壓形成的機(jī)制。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是一促血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖因子,具有強(qiáng)烈的促有絲分裂作用,其在肺高壓形成中的機(jī)制研究很多,但其與MMPs之間的關(guān)系目前未見相關(guān)研究。本研究采用左肺切除加野百合鹼(MCT)制作肺高壓模型,并以卡托普利或氯沙坦進(jìn)行干預(yù),探討血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)和AT1受體拮抗劑對肺動脈高壓中ECM重構(gòu)的影響,以期進(jìn)一步闡明ACEI和AT1受體拮抗劑阻遏PAH肺血管重構(gòu)的可能機(jī)制。1對象和方法1.1中心提供了學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供健康雄性SD大鼠(體質(zhì)量350～400g)40只,由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為4組,每組10只:正常對照組(Control)、左肺切除+MCT組(PAHModel)、卡托普利干預(yù)組(PAH+Cap)、氯沙坦干預(yù)組(PAH+Los)。1.2動物呼吸動力學(xué)檢查左肺切除術(shù)參照文獻(xiàn)并加以改進(jìn),術(shù)前肌注阿托品(50μg/kg),腹腔注射10%水合氯醛(0.04mL/kg)麻醉,用內(nèi)徑?2mm的導(dǎo)管在直視下行氣管插管,用HX200小動物呼吸機(jī)(成都泰盟科技)維持有效通氣。在無菌技術(shù)條件下沿左第5肋間切開胸壁和胸膜腔,結(jié)扎左肺肺門并切除左肺,用生理鹽水沖洗殘端,逐層關(guān)閉胸壁。觀察大鼠呼吸情況平穩(wěn)后拔管。所有動物術(shù)后吸氧24h(2L/min籠),以后吸常氧。1周后于大鼠項(xiàng)背部皮下注射MCT(60mg/kg)。動物于手術(shù)后35d(MCT注射后4周)行血流動力學(xué)檢查后處死。藥物干預(yù)組從左肺切除術(shù)前3d起分別給予卡托普利10mg/(kg·d)或氯沙坦15mg/(kg·d)喂水給藥直至處死前2d。所有動物均自由飲水和攝食,并給予人性化管理。1.3肺動脈平均壓mpap用10%水合氯醛腹腔麻醉,經(jīng)頸外靜脈切開,插管至肺總動脈,用PM-8000型多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀(深圳邁瑞)記錄肺動脈平均壓(mPAP)。測壓后處死動物,游離心臟和右肺。取出心臟,去掉心房及大血管,游離右心室(RV)和左心室加室間隔(LV+S),洗去血液,用濾紙吸去表面水分后用電子天平稱重,計(jì)算RV/(LV+S)并記錄。1.4肺he染色及elastinnagieson檢測用生理鹽水通過右肺動脈沖洗剩余的血液,繼用10%中性福爾馬林在20cmH2O壓力下經(jīng)氣管緩慢注入肺內(nèi),使肺胸膜平滑膨脹,5min后切取右下肺,10%中性福爾馬林液中固定,常規(guī)石蠟包埋切片,作HE染色和ElastinVanGieson染色,進(jìn)行如下檢測。1.4.1sm--actin染色SP法行SM-α-actin免疫組織化學(xué)染色(小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體,武漢博士德),每只動物隨機(jī)觀察20個高倍視野(×400),統(tǒng)計(jì)直徑在15～50μm的腺泡內(nèi)小動脈(30根)。SM-α-actin染色陽性即為肌化。非肌性血管肌化程度(Muscularization%)=(完全肌化+部分肌化的血管數(shù))/觀察血管總數(shù)×100%。免疫組化染色切片用Image-ProPlus軟件掃描作積分光密度(IOD)值半定量分析,每只動物隨機(jī)觀察20個視野(×400)取平均值。1.4.2rolus圖線的采集光鏡(×400)下觀察ElastinVanGieson染色切片,在Image-Proplus圖象采集處理系統(tǒng)中,計(jì)算肺小動脈(每只動物30根,直徑在50～150μm之間)的中膜厚度(內(nèi)、外彈力板之間的厚度,WT)和血管的外徑(外彈力板的平均直徑,ED)。根據(jù)公式計(jì)算中膜厚度百分比:WT%=(2×WT/ED)×100%。1.4.3在400倍光鏡下觀察新腦膜，并觀察50.150μm肺小動脈,在內(nèi)彈力板內(nèi)側(cè)、內(nèi)皮細(xì)胞外側(cè)部分即為新生內(nèi)膜。1.5陰性對照法肺組織石蠟切片,用免疫組織化學(xué)SP法染色(MMP-2、MMP-9和TIMP-1小鼠抗大鼠多克隆抗體,武漢博士德,PBS代替一抗做陰性對照),以胞漿或胞膜呈均一棕黃色顆粒者細(xì)胞為陽性,無棕黃色顆粒者的細(xì)胞為陰性。結(jié)果判定參考文獻(xiàn):采用Image-ProPlus圖象分析軟件,切片在光鏡下(×400倍)進(jìn)行分析,每張切片按等距抽樣原則隨機(jī)攝取5個視野,輸入計(jì)算機(jī)作為測定視場,采用IOD進(jìn)行半定量分析。1.6引物及其pcr擴(kuò)增肺組織總RNA提取:取冰凍肺組織,嚴(yán)格按照Trizol產(chǎn)品說明書進(jìn)行,所得RNA完整性經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。-70℃保存?zhèn)溆?。cDNA合成:參照RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(立陶宛MBI公司)進(jìn)行,所得cDNA用于PCR擴(kuò)增或-20℃保存?zhèn)溆?。FQ-PCR擴(kuò)增目的基因:根據(jù)NCBIGenBank中大鼠MMP-2、9、TIMP-1及GAPDH基因序列行引物設(shè)計(jì)。MMP-2:上游引物為5′-GAGTTGGCAGTGCAATACCT-3′,下游引物為5′-CCAAAGAACTTCTGCATCTTCT-3′,引物片段長度為104bp;MMP-9:上游引物為5′-CTTCGAGGGCCACTCCTACT-3′,下游引物為5′-CAGTGACGTCGGCTCGAGT-3′,引物片段長度為129bp;TIMP-1:上游引物為5′-GCAACTCGGACCTGGTTAT-3′,下游引物為5′-GTCGAATCCTTTGAGCATCTT-3′,引物片斷長度為113bp;GAPDH:上游引物為5′-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3′,下游引物為5′-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3′,引物片段長度為141bp。引物由TaKaRa公司合成并經(jīng)質(zhì)量檢測。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)SYBRGreenⅠ,反應(yīng)體系在FTC2000型熒光定量PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2min,然后94℃變性20s,55℃退火30s,72℃延伸40s,進(jìn)行45個循環(huán)。在PCR反應(yīng)過程中,設(shè)定無cDNA樣品的空白管做為陰性對照。結(jié)果分析:取一待測cDNA樣品,按10倍梯度稀釋后,在同樣反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以樣品拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo),Ct值為縱坐標(biāo),分別擬合MMP-2、9、TIMP-1和GAPDH的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。在目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率一致的基礎(chǔ)上,目的基因的量=2-ΔΔCt,它表示實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù),我們將ΔΔCt作為定量的最后結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。1.7濃縮膠凝法明膠酶譜法根據(jù)Kleiner等的方法進(jìn)行測定。肺組織蛋白質(zhì)提取及濃度測定:凍存肺組織制成勻漿,離心后取上清-20℃保存。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。制膠與電泳:采用分離膠8%、含明膠1%、濃縮膠4%制膠;電泳體系保持低溫。電泳結(jié)束后,用變性Buffer洗滌平衡。換上明膠Buffer,37℃孵箱中孵育約40h。染色與脫色:將凝膠放入50℃染色液中,染色約30～60min,然后放入脫色液中脫色,依脫色效果隨時中止脫色,然后放入蒸餾水中洗。成像分析:將所得結(jié)果于凝膠成像系統(tǒng)(GeLDoc2000,美國Bio-Rad)照相并使用Bio-RadQuantityOne(美國)軟件進(jìn)行分析,根據(jù)負(fù)染條帶的寬度以及亮度,半定量計(jì)算酶活性大小,以積分光密度(IOD)值表示。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示,FQ-PCR原始數(shù)據(jù)(Ct值)換算為ΔΔCt進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;各組比較采用方差分析和q檢驗(yàn),如果方差不齊采用秩和檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1卡托普利和氯沙坦干預(yù)組與正常組之間的比較表1由表1可見,PAH模型組4項(xiàng)指標(biāo)均明顯高于其它各組(P<0.01),卡托普利和氯沙坦干預(yù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但與正常對照組的差異仍明顯(P<0.05)。2.2增殖內(nèi)涵測定由圖1可見,PAH模型組小動脈管壁較其它各組明顯增厚,官腔變小,有明顯新生內(nèi)膜形成;卡托普利和氯沙坦組小動脈管壁較正常對照組增厚,但較PAH模型組變薄。2.3卡托普利和氯沙坦干預(yù)組與正常對照組比較由表2可見,PAH模型組3項(xiàng)指標(biāo)的陽性表達(dá)均高于其它各組(P<0.01),卡托普利和氯沙坦干預(yù)組之間差異不顯著,但二組與正常對照組的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.4mmp-2、9活性表達(dá)由圖2和表3可見,各組動物肺組織中MMP-2活性表達(dá)均較MMP-9高,PAH模型組的MMP-2、9活性表達(dá)與其它各組相比均明顯增高(P<0.01);各干預(yù)組MMP-2、9活性較PAH模型組下降,較正常組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3ras干預(yù)效果肺動脈高壓形成的中心環(huán)節(jié)是肺小動脈的重構(gòu),肺血管重構(gòu)主要表現(xiàn)包括動脈中膜肥厚、新生內(nèi)膜形成、內(nèi)膜纖維化、叢樣病變形成,以及ECM成分的改變和在肺血管壁中異常沉積。本研究發(fā)現(xiàn),PAH模型組mPAP明顯升高,右心室明顯肥厚,肺小動脈中膜厚度及肌化程度明顯增加,與其它各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而且有明確的新生內(nèi)膜形成。該模型形態(tài)學(xué)改變與人類梗阻性肺動脈高壓的血管重構(gòu)非常相似,是目前研究人類嚴(yán)重PAH的細(xì)胞和分子機(jī)制及其藥物干預(yù)適用的動物模型。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是體內(nèi)重要的心血管功能調(diào)節(jié)系統(tǒng),AngⅡ是其中主要的一種生物活性物質(zhì),臨床上應(yīng)用ACEI和AT1R拮抗劑干預(yù)治療體循環(huán)高血壓有明確療效,能否應(yīng)用ACEI和AT1R拮抗劑來干預(yù)PAH形成雖然有初步研究,但尚有待深入。我們近年研究發(fā)現(xiàn):RAS激活是左向右分流性先天性心臟病主要的神經(jīng)內(nèi)分泌改變,AngⅡ受體在該病體、肺循環(huán)表達(dá)的不平衡可能導(dǎo)致分流擴(kuò)大和心力衰竭,因而在大量左向右分流尤其合并心力衰竭的病例有使用ACEI的強(qiáng)烈指征。對于ACIE和AT1R拮抗劑對左向右分流肺動脈重構(gòu)有何影響這一問題,我們通過大鼠高血流模型的研究,初步得出干預(yù)RAS可以減輕其肺血管重構(gòu)的結(jié)論。本研究采用模擬梗阻性PAH的動物模型對干預(yù)RAS的效果進(jìn)行觀察,結(jié)果表明不論使用ACEI還是AT1R拮抗劑,均能明顯減輕肺動脈高壓及其肺血管重構(gòu),包括抑制新生內(nèi)膜的形成。本研究在PAH模型組檢測到肺組織MMP-2、MMP-9和TIMP-1mRNA表達(dá)及其蛋白合成明顯增高,明膠酶譜檢測MMP-2、MMP-9活性亦明顯增高,卡托普利或氯沙坦干預(yù)均可誘導(dǎo)上述指標(biāo)的明顯下降。這與應(yīng)用AngⅡ刺激體外培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞可誘導(dǎo)TIMP-1的表達(dá)增加以及AngⅡ可誘導(dǎo)MMP-2在大鼠頸動脈平滑肌細(xì)胞的高表達(dá),氯沙坦可抑制其表達(dá)等在體循環(huán)的離體研究結(jié)果一致。已知抑制MMPs可以在若干PAH動物模型阻遏肺動脈重構(gòu),提示MMPs激活可能是各種PAH血管重構(gòu)過程中具有普遍意義的現(xiàn)象,抑制MMPs可以作為干預(yù)治療PAH的一種新策略。本研究的結(jié)果提示AngⅡ亦能誘導(dǎo)MMPs的過度表達(dá),ACEI或AT1R拮抗劑的干預(yù)均能抑制MMPs過度表達(dá)。由此可以推論:RAS激活促進(jìn)PAH發(fā)病的機(jī)制并不單純是AngⅡ的絲裂原作用,誘導(dǎo)MMPs的過度表達(dá)可能是其致病機(jī)理的又一可能解釋。ACEI或AT1R拮抗劑的干預(yù)作用不論在抑制MMPs活性還是減