第二節(jié) 基因克隆的基本過(guò)程

第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程1.分1、目的DNA的分離獲取2、載體的選擇與構(gòu)建3、目的DNA與載體連接4、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞5、重組體的篩選與鑒定2.選3.接4.轉(zhuǎn)5.篩

第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程一、目的DNA的分離獲取二、載體的選擇與構(gòu)建三、目的DNA與載體連接1、黏端連接2、平端連接3、黏平連接

第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程一、目的DNA的分離獲取二、載體的選擇與構(gòu)建三、目的DNA與載體連接1、黏端連接

⑴單一相同黏端連接⑵不同黏端連接⑶產(chǎn)生黏端連接1、黏端連接重組體⑴單一相同黏端連接:載體自連目的DNA自連

第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程三、目的DNA與載體連接1、黏端連接⑴單一相同黏端連接用同一種RE切割目的DNA和載體缺點(diǎn)：目的DNA多拷貝載體自身環(huán)化目的DNA雙向插入

⑴單一相同黏端連接載體自身環(huán)化:

堿性磷酸酶預(yù)處理線性化載體DNA，載體切口的5’磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。

第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程三、目的DNA與載體連接1、黏端連接⑴單一相同黏端連接用同一種RE切割目的DNA和載體缺點(diǎn)：目的DNA多拷貝載體自身環(huán)化目的DNA雙向插入

VectorEcoRIEcoRIEcoRIVectorREdigestionREdigestionLigationRecombinantvectorRecombinantvectorRecombinantvectorEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI—單酶切基因片段的連接:連接沒(méi)有方向性⑴單一相同黏端連接目的基因雙向插入

三、目的DNA與載體連接1、黏端連接⑴單一相同黏端連接⑵不同黏端連接EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI不同黏端連接EcoRI+HindIIIGAATTCAAGCTTCTTAAGTTCGAATargetDNA

AATTCA

GTTCGA

VectorG

AATTCCTTAA

GTTCGA

AEcoRI+HindIIIGAGCTTCTTAA

AAAGCTTCTTAAGTTCGAAGAATTCAAGCTTDNALigase⑵不同黏端連接TargetgeneEcoRIBamHIEcoRIBamHIVectorVectordigestiondigestionLigationVectorEcoRIBamHI—雙酶切基因片段的連接:有方向性⑵不同黏端連接

第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程一、目的DNA的分離獲取二、載體的選擇與構(gòu)建三、目的DNA與載體連接1、黏端連接⑴單一相同黏端連接⑵不同黏端連接⑶產(chǎn)生黏端連接①人工接頭法②加同聚物尾法③PCR法

1、黏端連接⑶產(chǎn)生黏端連接①人工接頭法：化學(xué)合成含有RE切點(diǎn)的平端寡核苷酸片段。與平端DNA連接，再用RE切割，產(chǎn)生粘性末端，而后進(jìn)行黏端連接。

1、黏端連接⑶產(chǎn)生黏端連接①人工接頭法：5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA

T(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體⑶產(chǎn)生黏端連接①人工接頭法②加同聚物尾法

⑶產(chǎn)生黏端連接①人工接頭法②加同聚物尾法③PCR法：

在引物的5′端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

5’--3’GCTAGCTGG

-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGACCEcoRI位點(diǎn)BamHI位點(diǎn)兩端為粘性末端的目的DNAPCRTargetDNAsequence

AATTC

5’--3’GCTAG

-5’3’-

GCEcoRI+BamHI⑶產(chǎn)生黏端連接①人工接頭法②加同聚物尾法③PCR法

T-Vector5'5'TT5'5'AAPCRproductRecombinantvector

AATTLigation⑶產(chǎn)生黏端連接①人工接頭法②加同聚物尾法③PCR法④T-A克隆:在使用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的3’端可添加上一個(gè)單獨(dú)的腺苷酸殘基（A）而成為黏端，這樣的PCR產(chǎn)物可直接與帶有3’T的線性化載體（T載體）連接，此即T-A連接。⑶產(chǎn)生黏端連接④T-A克隆三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲?。ǘ┹d體的選擇與構(gòu)建（三）目的DNA與載體連接1、黏端連接2、平端連接缺點(diǎn)：載體自身環(huán)化目的基因雙向插入基因多拷貝

AATTC

GGCTTAA

CTTAAGGAATTCDNALigaseTargetDNAVector三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲?。ǘ┹d體的選擇與構(gòu)建（三）目的DNA與載體連接1、黏端連接2、平端連接3、黏平連接

定向克隆基因克隆的基本過(guò)程1.分1、目的DNA的分離獲取2、載體的選擇與構(gòu)建3、目的DNA與載體連接4、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞5、重組體的篩選與鑒定2.選3.接4.轉(zhuǎn)5.篩第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程一、目的DNA的分離獲取二、載體的選擇與構(gòu)建三、目的DNA與載體連接四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞宿主細(xì)胞大腸桿菌JM109遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，重組子穩(wěn)定；不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA-----DNA(蛋白質(zhì))降解系統(tǒng)缺陷株對(duì)宿主細(xì)胞的要求：容易接受重組DNA分子---感受態(tài)細(xì)胞（處于易于接納外源物質(zhì)狀態(tài)的細(xì)菌）對(duì)載體的復(fù)制無(wú)嚴(yán)格的限制,保證外源DNA長(zhǎng)期穩(wěn)定地遺傳(或表達(dá))第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程一、目的DNA的分離獲取二、載體的選擇與構(gòu)建三、目的DNA與載體連接四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化2、轉(zhuǎn)染3、感染四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌或酵母細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)化方法：化學(xué)方法(氯化鈣法)物理方法(電穿孔法)用CaCl2處理大腸桿菌，Ca2+

與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài)。一般用于細(xì)菌的轉(zhuǎn)化氯化鈣轉(zhuǎn)化法四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化：化學(xué)方法(氯化鈣法)將大腸桿菌細(xì)胞置于冰冷的CaCl2溶液中，然后瞬間加熱，外源DNA隨即轉(zhuǎn)入大腸桿菌。用氯化鈣法使大腸桿菌處于感受態(tài)，從而將外源導(dǎo)入細(xì)胞，至今仍然是應(yīng)用最廣的方法。第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌或酵母細(xì)胞的過(guò)程。2、轉(zhuǎn)染：將外源DNA直接導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。（包括噬菌體導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程）轉(zhuǎn)化方法：化學(xué)方法(磷酸鈣共沉淀法，脂質(zhì)體融合法)物理方法(顯微注射法，電穿孔法)第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2、轉(zhuǎn)染：電穿孔法第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2、轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

脂質(zhì)體（liposome）是一種人工膜。在水中磷脂分子親水頭部插入水中，脂質(zhì)體疏水尾部伸向空氣，攪動(dòng)后形成雙層脂分子的球形脂質(zhì)體，直徑25－1000nm不等。第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2、轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法原理：脂質(zhì)體分子的陽(yáng)離子部分與帶有負(fù)電荷的核酸（磷酸鹽上的負(fù)電荷）相連，形成脂質(zhì)體/核酸復(fù)合物。該復(fù)合物所剩下的所有正電荷還可與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷相連，從而提高轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2、轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染過(guò)程：(1)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，密度達(dá)到50～60%。

(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物。

(3)向每孔中直接加入DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3～5小時(shí)。

第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒→細(xì)菌質(zhì)粒→酵母2、轉(zhuǎn)染：DNA→真核細(xì)胞

噬菌體DNA→細(xì)菌3、感染：噬菌體顆?！?xì)菌病毒顆粒→真核細(xì)胞

優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)移效率較高?；蚩寺〉幕具^(guò)程1.分1、目的DNA的分離獲取2、載體的選擇與構(gòu)建3、目的DNA與載體連接4、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞5、重組體的篩選與鑒定2.選3.接4.轉(zhuǎn)5.篩第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程一、目的DNA的分離獲取二、載體的選擇與構(gòu)建三、目的DNA與載體連接四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程一、目的DNA的分離獲取二、載體的選擇與構(gòu)建三、目的DNA與載體連接四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞五、重組體的篩選與鑒定篩選策略：先篩選出帶有載體的克??；然后篩選出帶有重組載體的克??；最后鑒定出帶有目的DNA的克隆。第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程一、目的DNA的分離獲取二、載體的選擇與構(gòu)建三、目的DNA與載體連接四、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法2、序列特異性篩選法3、親和篩選法五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：

五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：

含有載體的細(xì)菌第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：載體上需要有兩個(gè)篩選標(biāo)志外源DNA插入其中一個(gè)篩選標(biāo)志使其失去篩選作用另一個(gè)篩選標(biāo)志仍發(fā)揮作用（2）利用基因的插入失活特性篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：pBR3224363bpTetRAmpRBamHIOriginpBR3224363bpBamHIOriginBamHIOriginpBR3224363bpBamHIBamHIBamHI+如何得到含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌？（2）利用基因的插入失活特性篩選：篩選策略：先篩選出帶有載體的克??；然后篩選出帶有重組載體的克隆；最后鑒定出帶有目的DNA的克隆。（2）利用基因的插入失活特性篩選：篩選策略：先篩選出帶有載體的克??；然后篩選出帶有重組載體的克??；最后鑒定出帶有目的DNA的克隆。Plate+ampicillinPlate+ampicillinandtetracycline重組質(zhì)粒Transfer第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：載體上的標(biāo)志基因表達(dá)，補(bǔ)救宿主細(xì)胞的缺陷基因，使細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上存活。1、遺傳標(biāo)志篩選法（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：藍(lán)白篩選（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：乳糖操縱子載體帶有β-半乳糖苷酶C端（α片段）的編碼序列細(xì)胞帶有β-半乳糖苷酶N端（ω片段）的編碼序列有活性的β-半乳糖苷酶α-互補(bǔ)（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：α-互補(bǔ)（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：α-互補(bǔ)（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：α-互補(bǔ)白色克隆重組質(zhì)粒藍(lán)色克隆質(zhì)粒無(wú)目的基因平板上含有青霉素和X-gar.沒(méi)有外源基因插入，菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；如果外源基因插入位于LacZ基因內(nèi)部的MCS，則菌落呈白色。（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：藍(lán)白篩選（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：藍(lán)白篩選X-gal藍(lán)色產(chǎn)物

-半乳糖苷酶第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選：（4）利用噬菌體的包裝特性篩選：coscos12bp12bp48500bpNonessentialportionforreplicationLong(left)armShort(right)arm

第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法（4）利用噬菌體的包裝特性篩選：重組λDNA的長(zhǎng)度為其野生型長(zhǎng)度的75%～105%時(shí)，才能包裝形成有活性的噬菌體顆粒。第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法（1）利用抗生素抗性標(biāo)志篩選（2）利用基因的插入失活特性篩選（3）利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選（4）利用噬菌體的包裝特性篩選2、序列特異性篩選第二節(jié)基因克隆的基本過(guò)程五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法2、序列特異性篩選（1）RE酶切法（2）PCR法（3）核酸雜交法（4）DNA測(cè)序法五、重組體的篩選與鑒定2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：提取陽(yáng)性克隆的重組DNA從克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。DNA

Marker載體重組載體五、重組體的篩選與鑒定2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：提取陽(yáng)性克隆的重組DNA五、重組體的篩選與鑒定2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：提取陽(yáng)性克隆的重組DNA

Linearvector(2700bp)insert(300bp)

M空質(zhì)粒重組質(zhì)粒NcoIHindIII2700bp300bp提取陽(yáng)性克隆的重組DNARE消化電泳有無(wú)DNA片段的插入；插入片段的大小五、重組體的篩選與鑒定2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段五、重組體的篩選與鑒定2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在a、提取陽(yáng)性克隆重組DNAb、用特異引物進(jìn)行PCRc、電泳PCR產(chǎn)物d、判斷PCR產(chǎn)物是否與外源DNA一致NcoIHindIII2700bp300bp五、重組體的篩選與鑒定2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在（3）核酸雜交法：原位雜交鑒定陽(yáng)性克隆五、重組體的篩選與鑒定2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在（3）核酸雜交法：原位雜交鑒定陽(yáng)性克?。?）DNA測(cè)序法：最準(zhǔn)確的鑒定方法五、重組體的篩選與鑒定1、遺傳標(biāo)志篩選法2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在（3）核酸雜交法：原位雜交鑒定陽(yáng)性克?。?）DNA測(cè)序法：最準(zhǔn)確的鑒定方法3、親和鑒定法：抗原-抗體反應(yīng)Ab基因克隆的基本過(guò)程1.分1、目的DNA的分離獲取2、載體的選擇與構(gòu)建3、目的DNA與載體連接4、重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞5、重組體的篩選與鑒定2.選3.接4.轉(zhuǎn)5.篩基因的研究蛋白質(zhì)研究生物制藥基因診斷基因治療醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)基因植物測(cè)序功能突變/改造序列結(jié)構(gòu)分析功能基因工程以基因克隆為基礎(chǔ)第三節(jié)克隆基因的表達(dá)基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程。蛋白表達(dá)系統(tǒng)是指由外源基因、載體、宿主細(xì)胞和輔助成分組成的體系。重組子目的基因的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)錄：DNA作為模板直接指導(dǎo)RNA分子生物合成的過(guò)程.DNA模板,RNA聚合酶,NTP翻譯：mRNA作為模板直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成的過(guò)程。mRNA，核糖體，tRNA基因表達(dá)原核生物基因的表達(dá)真核生物基因的表達(dá)*連續(xù)基因*斷裂基因：內(nèi)含子與外顯子*染色體位于類核，與細(xì)胞漿相通*染色體位于細(xì)胞核，核膜使其與細(xì)胞漿相隔#一種RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄#三種RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄#轉(zhuǎn)錄與翻譯同時(shí)進(jìn)行#翻譯后蛋白產(chǎn)物需翻譯后修飾#mRNA無(wú)需加工#mRNA要經(jīng)過(guò)剪接去除內(nèi)含子，加帽、加尾#轉(zhuǎn)錄以多順?lè)醋訛閱挝?轉(zhuǎn)錄以單順?lè)醋訛閱挝?轉(zhuǎn)錄與翻譯分開(kāi)進(jìn)行#翻譯的蛋白產(chǎn)物無(wú)翻譯后修飾第三節(jié)克隆基因的表達(dá)基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程。蛋白表達(dá)系統(tǒng)是指由外源基因、載體、宿主細(xì)胞和輔助成分組成的體系。原核表達(dá)系統(tǒng)ProkaryoticexpressionsystemEukaryoticexpressionsystem真核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌枯草芽胞桿菌鏈霉菌酵母細(xì)胞昆蟲細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞RecombinantvectorpromoterTargetgeneProteinsTransformation/Transfection第三節(jié)克隆基因的表達(dá)1、原核表達(dá)體系：

主要利用細(xì)菌表達(dá)外源蛋白，最早被研究的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。（1）表達(dá)載體特點(diǎn)：①克隆載體②轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(強(qiáng)啟動(dòng)子)③翻譯控制序列(SD序列和翻譯起始點(diǎn))④合理的MCS大腸桿菌表達(dá)載體的基本組成R：調(diào)節(jié)序列；P：?jiǎn)?dòng)子；SD：SD序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列MCS第三節(jié)克隆基因的表達(dá)1、原核表達(dá)體系：（1）表達(dá)載體特點(diǎn)：①克隆載體②轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(強(qiáng)啟動(dòng)子)③翻譯控制序列(SD序列和翻譯起始點(diǎn))④合理的MCS強(qiáng)啟動(dòng)子終止子SD序列oriPT7SDMCSTerminatorProkaryoticExpressionPlasmid

ProkaryoticpromoterLacIstartpiontAmpicillinresistance克隆元件：表達(dá)元件：插入位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)篩選標(biāo)記（1）表達(dá)載體特點(diǎn)：成熟型融合型分泌型減少原核細(xì)胞對(duì)外源蛋白的降解------天然完整蛋白-----融合蛋白----分泌性蛋白（2）表達(dá)載體類型：oripromoterSDMCSExpressionvector特點(diǎn)：外源基因需攜帶ATG和TAA只表達(dá)目的基因編碼的氨基酸產(chǎn)生天然蛋白，容易被降解，因此產(chǎn)量小，也可能不穩(wěn)定。缺點(diǎn)!PForeignDNA①成熟型表達(dá)載體：

表達(dá)載體含有一段編碼原核蛋白的基因順序，使表達(dá)的蛋白質(zhì)N端或C端帶著一小段原核多肽。

②成熟型表達(dá)載體：融