sz誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型的研究

sz誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型的研究

糖尿病是中醫(yī)學(xué)的三大疑難疾病之一，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢。目前,糖尿病及其并發(fā)癥的病因、發(fā)病機理尚未完全闡明,其預(yù)防和治療措施仍不完善,因此,建立較理想的動物模型來研究該病的發(fā)病機制、預(yù)防和治療具有重要意義。自1960年開始利用鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘發(fā)動物糖尿病模型以來,STZ已成為目前廣泛采用的糖尿病動物模型化學(xué)誘導(dǎo)劑。有研究指出大鼠尾靜脈注射STZ成模率可達90%,因腹腔注射較尾靜脈注射容易、準(zhǔn)確快速,現(xiàn)多采用腹腔注射法。判斷造模成功的指標(biāo),研究中多采用測外周血糖、尿糖、血清胰島素水平、C肽值等。國外有學(xué)者采用口服葡萄糖耐量試驗(oralglucosetolerancetest,OGTT)作為判斷與比較糖尿病情況的指標(biāo)之一,有學(xué)者在用STZ誘發(fā)大鼠糖尿病模型的研究中,但也只用空腹血糖值作為判斷大鼠成模的指標(biāo),較少使用OGTT。筆者在研究過程中發(fā)現(xiàn),單用空腹血糖值無法反映出大鼠造模的真實情況,因此,本試驗在觀察大鼠品系、給藥劑量、給藥次數(shù)對大鼠成模影響的同時,研究與空腹血糖相比,OGTT對判斷大鼠糖尿病成模的意義。1材料和方法1.1實驗動物中心清潔級Wistar雄性大鼠24只,清潔級SD雄性大鼠60只,體重170g~200g,購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室。標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房籠子喂養(yǎng),飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18℃~22℃,室內(nèi)濕度保持在50%~70%,每天日照時間為8:00~20:00。試驗前測定每只大鼠的血糖值范圍在3.0mol/L~5.0mmol/L之間,為正常血糖值,可以進行造模試驗。1.2stz分散菌種的制備STZ(Sigma公司,S0130),將STZ粉末溶于pH4.5的0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液,新鮮配制成10g/LSTZ溶液,用0.2μm微菌濾菌器過濾除菌;美國強生穩(wěn)豪微量血糖測定儀(配套血糖試紙)。1.3方法1.3.1單次給藥后sd大鼠成模率測定動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,飲食正常、體重不減輕,且尾尖采血測定血糖值正常的大鼠可用于試驗。注射STZ前1d禁食不禁水24h。根據(jù)不同試驗?zāi)康姆譃?個試驗,同時進行。隨機取16只SD大鼠作為6個試驗組的正常對照組,腹腔注射1mL檸檬酸鈉緩沖液。試驗一采用24只Wistar鼠隨機分為中劑量組(55mg/kg)和高劑量組(65mg/kg),每組12只,均一次性腹腔注射。試驗二采用12只SD鼠一次性腹腔注射STZ55mg/kg,與試驗一注射劑量為55mg/kg的Wistar鼠作比較。試驗三采用32只SD大鼠分為一次給藥組和兩次給藥組。一次給藥組一次性腹腔注射STZ55mg/kg,兩次給藥組第1次腹腔注射STZ55mg/kg,第8天行第2次腹腔注射同等劑量STZ,觀察期間進行OGTT,并對比按空腹血糖值和OGTT結(jié)果分別計算出的大鼠成模率。以上試驗均在注射STZ5d后大鼠尾尖采血測空腹血糖值,觀察8周,計算成模率和死亡率。1.3.2微量血糖測定①觀察大鼠飲水量和一般狀態(tài),每周測量體重;②空腹血糖測定:大鼠禁食8h后尾尖采血,用微量血糖測定儀測血糖。③口服葡萄糖耐量試驗(OGTT):試驗前一晚大鼠禁食,第2天測空腹血糖后,每只大鼠灌服500g/L葡萄糖,2.5g/kg,測灌服葡萄糖后0.5、1、2、3h的血糖值。1.3.3成功評價模型的標(biāo)準(zhǔn)注射STZ5d后動物空腹血糖值>16.7mmol/L,或OGTT異常者,判定為1型糖尿病動物模型,并結(jié)合胰腺組織病理切片。1.3.4病理樣品的采集和處理試驗結(jié)束后將大鼠處死,剖腹,觀察胰、肝、腎等臟器是否有病變,用100mL/L福爾馬林固定液固定、脫水,石蠟包埋,HE染色。1.4統(tǒng)計方法采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較采用t檢驗,方差不齊時用F檢驗。2結(jié)果2.1高劑量組65g/l的成模率和死亡率Wistar鼠中劑量組(55mg/kg)的成模率和死亡率均為66.7%,高劑量組(65mg/kg)的成模率和死亡率均為100%(表1)。2.2空腹血糖造模成功標(biāo)準(zhǔn)比較Wistar鼠和SD鼠在給藥一次,劑量為55mg/kg的條件下,以空腹血糖>16.7mmol/L為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。兩個品系的大鼠其成模率分別為83.3%和33.3%,死亡率分別為83.3%和0(表2)。2.3不同的給藥次數(shù)對stz對大鼠糖尿病模型的影響SD大鼠一次給藥的成模率為31.25%,死亡率為0,兩次給藥的成模率為50%,死亡率為0(表3)。2.4人胰腺病理檢測在模型組中,隨機同時檢測空腹血糖和OGTT。結(jié)果發(fā)現(xiàn),空腹血糖值與OGTT的異常陽性率分別為50%和75%,胰腺病理檢測發(fā)現(xiàn),OGTT異常的大鼠均有明顯病理改變,即胰島變小,密度減低,胰島分布稀疏,胰島細(xì)胞數(shù)量減少、腫脹,胞質(zhì)著色淺,細(xì)胞核固縮。結(jié)果見表4和圖1B,圖1D。2.5大鼠體內(nèi)壓力隨著病程進展,模型組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食、毛失去光澤、脫毛、消瘦、活動減少和傷口易感染等表現(xiàn)。觀察8周,模型組大鼠體重減輕20%,飲水量增加近180%。2個月后1只出現(xiàn)爛尾和糖尿病足,1只出現(xiàn)嘴角潰瘍。2.6胰島細(xì)胞團型將大鼠處死,取胰腺組織做病理檢測。胰腺病理檢測普通HE染色顯示,正常對照組胰島為圓形、卵圓形細(xì)胞團,界限清、無包膜,細(xì)胞團塊大小不一,胰島細(xì)胞數(shù)量較多,胞質(zhì)豐富,核圓形,胰島分布廣(圖1A,圖1C);糖尿病模型組胰腺常規(guī)HE染色中胰島變小,密度減低,胰島分布稀疏,胰島細(xì)胞數(shù)量減少、腫脹,胞質(zhì)著色淺,細(xì)胞核固縮(圖1B,圖1D)。3大鼠stz后感染情況的變化STZ是一種廣譜抗生素,具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副作用,對動物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的毒性作用,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用STZ制備糖尿病動物模型。有文獻指出采取兩步給藥法,STZ劑量為10mg/kg,隔1d給予50mg/kg,其成模率高,死亡率低,成模穩(wěn)定。本試驗亦采用兩次給藥法,其成模率高于一次給藥組,死亡率為0,到試驗結(jié)束維持時間達3個月。STZ成模率不及一些文獻報道的可達80%~90%,其原因可能是注射的劑量不同,實驗大鼠間個體差異較大,也可能與地域差別及腹腔注射范圍大,注射藥物易誤入皮下或腹腔臟器等有關(guān)?？赏ㄟ^加大STZ的注射劑量或尾靜脈注射等方法來提高成模率,但隨著劑量的增加,死亡率會有增加的趨勢。HainanC等報道造模未成功的大鼠,與一種抗氧化蛋白——金屬硫蛋白Metallothionein(MT)作用有關(guān),MT可在一些細(xì)胞中保護DNA免受化學(xué)損傷,推測是由于MT的過表達能夠保護β細(xì)胞的DNA免受損傷,從而阻止了STZ導(dǎo)致糖尿病。因STZ具有毒性和副作用,會導(dǎo)致大鼠死亡。試驗一高劑量組Wistar大鼠注射STZ后7d內(nèi)死亡率達100%,2個月仍存活的4只均屬中劑量組。試驗三中SD大鼠一次給藥組和兩次給藥組注射STZ后均無死亡。其一與注射劑量有關(guān),劑量大于大鼠可耐受程度,毒性或副作用導(dǎo)致大鼠死亡。其二可能與大鼠品系和體質(zhì)有關(guān)。Wistar大鼠給藥后成模率與死亡率均高于SD大鼠,推斷Wistar大鼠對STZ敏感性高于SD大鼠,但其抵抗力低于SD大鼠。此僅為試驗結(jié)果的初步推斷,有研究亦提出造模時SD鼠可能優(yōu)于Wistar鼠。目前,很多研究使用Wistar鼠作為造糖尿病動物模型的實驗對象,本試驗與以往研究有差異,可能是例數(shù)不多或為偶發(fā)事件,需重復(fù)再研究。給藥后的1周內(nèi)應(yīng)加強大鼠的飼養(yǎng),勤換墊料,防止感染,盡量減少大鼠死亡。因試驗條件原因,本試驗沒有比較不同劑量對SD大鼠造模情況的影響。OGTT是在當(dāng)血糖升高的程度未達到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),不能確診糖尿病而進行的一種進一步確診糖尿病的檢驗措施。通過OGTT可以了解和觀察糖代謝功能是否健全,對隱匿型糖尿病的診斷有重要意義?？赡芤騉GTT較花費時間,動物數(shù)量多時需耗較多人力物力,故試驗中較少應(yīng)用。比較空腹血糖值和OGTT異常陽性率發(fā)現(xiàn),動物試驗中空腹血糖值并不能很準(zhǔn)確地反映出動物成模的真實情況,有的大鼠其空腹血糖值