宮頸組織中reg細(xì)胞和吲哚胺2,3-二氧酶的表達(dá)及其臨床意義

宮頸組織中reg細(xì)胞和吲哚胺2,3-二氧酶的表達(dá)及其臨床意義

人類乳頭瘤病毒（hp）通過性傳播被感染。70.90%的pv感染可以在1.2年內(nèi)自行消除。一些感染患者仍然存在iv感染，導(dǎo)致環(huán)腺炎、宮頸皮炎和原位癌、潤(rùn)癌和轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生和發(fā)展。局部和全身免疫監(jiān)視系統(tǒng)的變化,決定了HPV感染的持續(xù)時(shí)間和是否發(fā)展為高級(jí)別病變,免疫逃逸在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。近年來,人們發(fā)現(xiàn),具有免疫調(diào)節(jié)功能的吲哚胺2,3-二氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO),可能與腫瘤免疫逃逸有關(guān),IDO通過阻斷T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性來抑制免疫反應(yīng),人類多種腫瘤組織和器官中可出現(xiàn)不同程度IDO表達(dá)。近期研究表明,在多種人類腫瘤中,CD4+CD25+Treg細(xì)胞參與抑制免疫反應(yīng),與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān),在宮頸癌的間質(zhì)和上皮組織中表達(dá)增強(qiáng),參與疾病的發(fā)生。本文檢測(cè)HPV感染相關(guān)宮頸疾病(宮頸炎、CINⅠ~Ⅲ、宮頸癌)中Treg細(xì)胞和IDO表達(dá)的變化,初步探討Treg細(xì)胞和IDO在宮頸癌進(jìn)行性發(fā)生發(fā)展中的意義。1材料和方法1.1納入研究對(duì)象的范圍和排除條件選擇2009年7月~2011年2月我院收治的194例女性患者,平均年齡為(42.2±3.8)歲,其中包括子宮肌瘤行全子宮切除患者,其正常宮頸組織作為正常對(duì)照組。32例(16%)為正常宮頸組織,30例為宮頸炎(15%),60例(31%)為CINⅠ,27例(14%)為CINⅡ,21例(11%)為CINⅢ,24例(12%)為宮頸癌。除正常對(duì)照組,其他組患者均行HPV檢測(cè)、宮頸TCT檢查,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均行宮頸病理學(xué)檢查,根據(jù)HPV高危型檢測(cè)結(jié)果和組織學(xué)結(jié)果,按病變程度分為正常宮頸(對(duì)照組)和HPV陰性(HPV-)宮頸炎、HPV陽(yáng)性(HPV+)宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌6組實(shí)驗(yàn)組。納入研究患者應(yīng)排除以下條件:絕經(jīng)期婦女、妊娠、慢性疾病(糖尿病、過敏、自身免疫性疾病)、急性感染、口服避孕藥、曾接受過放化療及免疫治療,合并其他臟器腫瘤。HPV檢測(cè):宮頸組織樣本收集后送醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1樣品采集宮頸組織一部分用于病理檢查,一部分制成單細(xì)胞懸液用于細(xì)胞和IDO的檢測(cè)。細(xì)胞溶解于Trizol,RNA分離參照說明書進(jìn)行。1.2.2引物的合成及測(cè)序從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Entrez核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(EntrezNucleotidesdatabase)中檢索,應(yīng)用設(shè)計(jì)軟件Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì),然后將設(shè)計(jì)出的引物輸入BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較,最終得到特異的引物序列。所有引物均由上海賽百勝生物公司合成。設(shè)計(jì)出的引物序列如下:IDOsenseprimer:5’-TTTGCTAAAGGCGCTGTTGG-3’,IDOantisenseprimer:5’-CCTTCATACACCAGAC-CGTCTGA-3’;GAPDHsenseprimer:5’-ACAACAGC-CTCAAGATCATCAG-3’,GAPDHantisenseprimer:5’-GGTCCACCACTGACACGTTG-3’。1.2.3總rna提取RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA宮頸組織使用微量RNA提取試劑盒(QIAGEN)提取總RNA,具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。用MBI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)體系為20μl,全過程在冰上進(jìn)行。1.2.4循環(huán)循環(huán)的計(jì)算實(shí)驗(yàn)中Q-PCR所用染料為SYBRGreen。反應(yīng)條件均為95℃12min,然后95℃15s,60℃60s,共45個(gè)循環(huán)。以GAPDH的表達(dá)量作為內(nèi)參照。采用SYBRGreen試劑,可通過每一個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè),從而記錄產(chǎn)物量。1.2.5大鼠抗體檢測(cè)將收集的宮頸組織單細(xì)胞懸液計(jì)數(shù),每樣本細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到1×106個(gè)。檢測(cè)Treg細(xì)胞,加入鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體、鼠抗人CD25-PE單克隆抗體、鼠抗人CD127-ACEXA647單克隆抗體,室溫孵育30min。處理好的樣品應(yīng)用流式細(xì)胞儀常規(guī)進(jìn)行分析,以相應(yīng)的熒光標(biāo)記的同型對(duì)照IgG1染色細(xì)胞作為陰性對(duì)照,應(yīng)用EXPO2軟件分析結(jié)果。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSSFORWINDOWS16統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,并采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。2結(jié)果2.1hp檢測(cè)結(jié)果5組患者HPV檢測(cè)結(jié)果見表1。2.2陰道各組患者ctreg細(xì)胞占cd4+t細(xì)胞比例的比較宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ及CINⅠ組中,均選擇HPV高危型(+)的患者進(jìn)行Treg細(xì)胞表達(dá)檢測(cè),宮頸炎患者分為HPV(+)宮頸炎和HPV(-)宮頸炎組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,宮頸癌組中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例為(10.3±2.1)%,高于CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宮頸炎組[(7.7±1.6)%、(7.2±1.5)%,(6.8±1.3)%和(7.5±1.5)%],前5組患者又高于HPV(-)宮頸炎組及對(duì)照組[(4.1±0.8)%和(4.7±1.0)%],P均<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宮頸炎組間比較無明顯差異,見圖1。2.3cin、pv+宮頸炎及hp-宮頸炎檢測(cè)結(jié)果宮頸癌組宮頸組織中IDOmRNA表達(dá)水平為(1.72±0.28)×103拷貝,高于CINⅢ及CINⅡ組[(1.13±0.24)×103和(1.21±0.19)×103拷貝],這3組結(jié)果高于CINⅠ、HPV(+)宮頸炎、HPV(-)宮頸炎及對(duì)照組[(0.75.±0.09)×103、(0.68±0.10)×103、(0.71±0.08)×103和(0.62±0.09)×103拷貝],CINⅠ、HPV(+)宮頸炎、HPV(-)宮頸炎及對(duì)照組間無明顯差異,見圖2。3免疫組織ido表達(dá)水平在cin.腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中會(huì)演化出種種逃避免疫監(jiān)視的方式,導(dǎo)致宿主不能有效清除腫瘤而發(fā)生耐受,腫瘤誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制目前尚未完全闡明。近年來在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)區(qū)域IDO高表達(dá),造成局部微環(huán)境中色氨酸耗竭,同時(shí)伴有局部淋巴細(xì)胞中存在著Treg細(xì)胞水平增高的現(xiàn)象,兩者相互作用與影響,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞的監(jiān)視,IDO和Tregs的出現(xiàn)為研究腫瘤免疫耐受的機(jī)制提供了一個(gè)新的方向。IDO是色氨酸的犬尿素分解代謝途徑的限速酶,能在多種細(xì)胞特別是一些涉及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)關(guān)鍵步驟細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),通過分解代謝色氨酸抑制免疫細(xì)胞功能,是機(jī)體免疫耐受功能的重要調(diào)節(jié)因子。組織局部微環(huán)境中色氨酸的耗竭對(duì)T細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用,可能是腫瘤微環(huán)境中免疫耐受形成過程中的一個(gè)關(guān)鍵因素。Uyttenhove等發(fā)現(xiàn)人類多種腫瘤如肺、前列腺、胰腺等器官的腫瘤組織可出現(xiàn)不同程度IDO表達(dá)。Karanikas等觀察到各種類型肺癌腫瘤組織中IDO表達(dá)顯著高于鄰近正常肺組織。本研究中顯示SCC組宮頸組織中IDOmRNA高于CINⅢ及CINⅡ組,這3組結(jié)果高于CINⅠ、HPV(+)宮頸炎、HPV(-)宮頸炎及對(duì)照組,CINⅠ、HPV(+)宮頸炎、HPV(-)宮頸炎及對(duì)照組間無明顯差異。說明隨著病情進(jìn)展,即從宮頸炎、CINⅠ到CINⅡ、CINⅢ,再發(fā)展為宮頸癌,組織中IDO表達(dá)水平逐漸增高,提示隨著宮頸病變進(jìn)展,腫瘤組織已逐步建立起有利于腫瘤發(fā)展的免疫逃逸機(jī)制,可能通過表達(dá)IDO成功逃避機(jī)體免疫攻擊,使疾病發(fā)生發(fā)展。原因可能與IFN-γ能在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)IDO基因表達(dá)有關(guān)。由于HPV感染的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ,隨病情的進(jìn)展及腫瘤壞死和局部炎癥反應(yīng),腫瘤及周圍組織IFN-γ濃度逐漸增高,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、宿主APCs細(xì)胞及腫瘤組織中其他浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)IDO,使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫攻擊加速疾病進(jìn)展。惡性腫瘤局部浸潤(rùn)了各種免疫細(xì)胞,但是這些免疫細(xì)胞并不能有效清除腫瘤細(xì)胞,腫瘤局部浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞中有部分可能是充當(dāng)免疫負(fù)調(diào)節(jié)的角色,Treg細(xì)胞正是具有這一特性的免疫細(xì)胞,在腫瘤細(xì)胞免疫耐受以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明去除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的Tregs可以提高抗腫瘤特異性反應(yīng),有研究表明在CIN及宮頸癌患者外周血單核細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例增加,如果清除CD25+T細(xì)胞能提高HPV16E6和E7特異性輔助T細(xì)胞反應(yīng),表明內(nèi)在的抗HPV反應(yīng)存在。本文研究顯示宮頸癌患者宮頸組織中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例分別高于CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宮頸炎患者;宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ及HPV(+)宮頸炎這5組患者Treg細(xì)胞比例高于HPV(-)宮頸炎及正常宮頸組織組患者。前期研究結(jié)果顯示,CIN病變患者宮頸組織中Treg細(xì)胞數(shù)增加,并隨病變程度的加重呈漸進(jìn)性增加,而本文研究表明,HPV陽(yáng)性的CINⅠ~Ⅲ及宮頸炎患者中,Treg細(xì)胞比例無明顯差別,這與前期的研究有所出入。但是,前期研究中的CINⅠ~Ⅲ組患者包括HPV(+)和HPV(-),而本研究的CINⅠ~Ⅲ組患者僅僅為HPV(+),本文研究結(jié)果更能客觀說明高危型HPV感染持續(xù)存在,Treg細(xì)胞數(shù)增加,與宮頸病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。IDO表達(dá)與局部浸潤(rùn)的Tregs細(xì)胞間存在相關(guān)性,即IDO高表達(dá)伴隨著局部浸潤(rùn)Tregs比例增高,這在多個(gè)腫瘤或動(dòng)物模型中已有報(bào)道。IDO和Tregs間存在著一個(gè)類似于正反饋的調(diào)節(jié)環(huán)路,共同介導(dǎo)腫瘤的免疫耐受。然而Thuere等卻提出Tregs只在母體蛻膜上出現(xiàn),而IDO則在胎盤上表達(dá),同時(shí)Tregs在妊娠早期即出現(xiàn),而IDO在妊娠8天之后才表達(dá),因此,Treg可能不是誘導(dǎo)IDO表達(dá)的原因,這為IDO與Tregs間相互關(guān)系的研究提出了新的挑戰(zhàn)。本文研究結(jié)果顯示,在HPV感染相關(guān)宮頸疾病的不同階段進(jìn)展