乳酸菌黏附上皮細(xì)胞作用機(jī)制的研究進(jìn)展

乳酸菌黏附上皮細(xì)胞作用機(jī)制的研究進(jìn)展

現(xiàn)在，由于大量使用和濫用抗生素，動(dòng)物腸道菌群嚴(yán)重失衡，出現(xiàn)了大量幾種抗藥菌，動(dòng)物體對(duì)各種疾病的抵抗力降低，混合疾病增多，治療難度增加。同時(shí),因抗生素的大量應(yīng)用,造成畜產(chǎn)品的殘留增加、環(huán)境的污染。因而,抗生素等藥物的大量應(yīng)用造成的弊端已成為畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)嚴(yán)峻的問題。雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生素菌株的分離成功,使我們對(duì)于抗生素問題的解決充滿了希望,大量的試驗(yàn)結(jié)果表明,雙歧桿菌、乳酸菌對(duì)動(dòng)物體具有免疫增強(qiáng)、營養(yǎng)、抗御病原體的侵害等作用。這些有益菌的主要作用原理一是通過粘附抗性、競(jìng)爭(zhēng)排斥和免疫調(diào)節(jié)功能,限制有害菌體在體內(nèi)定植;二是通過分泌一些細(xì)菌素、氨基酸、維生素、酶類等產(chǎn)物幫助宿主消化和抑制有害菌生長(zhǎng)。目前,有關(guān)正常菌群在腸道的種類、數(shù)量及應(yīng)用效果的研究較多,而對(duì)于有益菌群與腸道粘膜的粘附和定植的機(jī)制和影響因素研究較少。本文對(duì)目前國內(nèi)外有關(guān)消化道乳酸菌的粘附機(jī)制及其影響因素方面的研究情況進(jìn)行綜述,以期對(duì)乳酸菌等有益菌的合理開發(fā)利用提供新的思路和理論依據(jù)。1共同語言理論1.1乳酸菌的粘連特性過去許多學(xué)者認(rèn)為,益生乳酸菌的粘附具有宿主特異性,而宿主特異性被認(rèn)為是益生菌的特有性質(zhì),因而被作為選擇益生素的標(biāo)準(zhǔn)之一。而又有報(bào)道,乳酸菌的粘附特性,并不具有宿主特異性,而是其自身的菌系特異性(RinkinenmM,2003;GusilsC,2002),乳酸菌的粘附特性主要是乳酸菌菌株的獨(dú)自特性,粘附性好的菌株對(duì)許多宿主來說都具有很好的粘附作用。宿主特異性學(xué)說認(rèn)為,宿主腸道上皮細(xì)胞上可能具有某種不同物質(zhì)與乳酸菌的粘附有關(guān),粘附物質(zhì)多少與粘附程度有關(guān)。而非特異性學(xué)說認(rèn)為在動(dòng)物生產(chǎn)中選擇益生乳酸菌菌株時(shí)首先要考慮高粘附性問題,不同菌株表面物質(zhì)不同,因而與腸道上皮細(xì)胞粘附程度不同。李平蘭等(2002)研究表明,來自豬和人類糞便的不同種類乳酸菌在體外與人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞的粘附能力不同,其中雙歧桿菌的粘附能力最高,平均在10.5個(gè)菌/細(xì)胞;乳桿菌的粘附能力較低,平均在3.2個(gè)菌/細(xì)胞;球菌的粘附能力很低,平均在2.3個(gè)菌/細(xì)胞,其中雙歧桿菌中的Bifidobacterium.bifidumO2菌株粘附能力最好,達(dá)到18.4±2.7個(gè)菌/細(xì)胞。乳桿菌中Lactobacillusacidophilus99101菌株粘附能力最好,達(dá)到10.2±1.8個(gè)菌/細(xì)胞,同時(shí),同種不同株的乳酸菌粘附能力有差異,而同屬中來自人糞便和來自豬糞便的乳酸菌的粘附能力沒有明顯差異。今后的研究工作應(yīng)該從兩方面著手,一是研究消化道不同部位的不同的粘附物質(zhì);二是篩選與腸道粘附因子相結(jié)合的特異的高粘附性的乳酸菌菌種。1.2宿主表面可能是受體隨著研究的不斷深入,科學(xué)家從分子水平角度逐漸發(fā)現(xiàn),粘附作用主要是乳酸菌體表面一些特定的分子如LTA(脂磷壁酸)、PSC(多糖)和粘附素蛋白等識(shí)別宿主表面特異的受體的結(jié)果。而宿主表面的蛋白、糖蛋白和糖脂有可能就是受體,可有選擇性地吸附特定種類的細(xì)菌,沒有被吸附的菌體被流體帶到不利于其生長(zhǎng)的環(huán)境中去。乳酸菌通過粘附素與腸粘膜細(xì)胞緊密結(jié)合,在腸粘膜表面定植占位,是形成生理屏障的主要組成部分,如果這個(gè)屏障遭到抗生素或其它因素的破壞,宿主便失去了對(duì)外來菌的抵抗力,就不能抵御外來菌的入侵或者會(huì)使具有耐性的腸內(nèi)菌異常增殖而取代優(yōu)勢(shì)菌的位置,造成腸道內(nèi)微生態(tài)平衡的失調(diào)。1.2.1組織形態(tài)功能腸道粘膜上皮細(xì)胞,包括粘膜上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞(可形成三葉狀蛋白,通過聚合粘性糖蛋白來保護(hù)上皮細(xì)胞免受外部損害,從而加強(qiáng)宿主防御)、潘氏細(xì)胞、未分化細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞,還有特異性的上皮細(xì)胞,如濾泡相關(guān)上皮細(xì)胞、膜上皮細(xì)胞、腸粘膜上皮細(xì)胞數(shù)量居多,核呈卵圓形,頂部有大量線粒體,胞質(zhì)內(nèi)有豐富溶酶體、微管、微泡系統(tǒng)發(fā)達(dá),細(xì)胞紋狀緣由致密微絨毛、腸上皮細(xì)胞間以緊密連接為主,刷狀緣表面分布致密的糖萼(糖衣)和堿性磷酸酶,它們與分泌型SIgA、杯狀上皮細(xì)胞分泌的粘液組成機(jī)體與外界的一層屏障,阻止絕大部分外來食物致病原的侵入。SannaEdelman等(2002)通過體外研究乳酸桿菌系對(duì)雞消化系統(tǒng)細(xì)胞和組織類型以及回腸粘液的粘附作用結(jié)果表明,乳酸桿菌粘附至嗉囊的上皮細(xì)胞上去,粘附到上皮的小囊濾泡以及成熟的腸道細(xì)胞的長(zhǎng)柔毛頂端,而未粘附到未分化腸細(xì)胞表面如生產(chǎn)粘膜的杯狀細(xì)胞或者回腸粘液表面。BernetMF等(1994)用嗜酸乳桿菌(Lbacidophilus)LA1株與腸致病菌一起同人結(jié)腸癌細(xì)胞系CaCo-2(相當(dāng)于腸上皮細(xì)胞)共同培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)腸致病菌的粘附能力受抑制,這可能是乳桿菌細(xì)胞與致病菌細(xì)胞之間存在的非特異性的對(duì)腸上皮細(xì)胞頂端受體的空間位阻現(xiàn)象引起的。MackDR(1999)研究提出乳酸菌可以通過改變腸道粘液成分抑制致病菌的粘附,腸道上皮組織細(xì)胞分泌的粘液覆蓋于腸道表面,其重要成分就是大分子的粘蛋白(含有長(zhǎng)碳水化合物鏈,通過O-糖苷鍵連接N-乙酰半乳糖胺和肽骨架上的蘇氨酸或絲氨酸),粘蛋白Muc2和Muc3是回結(jié)腸粘液中的優(yōu)勢(shì)蛋白。他們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌299V和鼠李糖乳桿菌GG能有效地抑制病原性大腸桿菌與腸上皮細(xì)胞系HT-29的粘附,但不能抑制其與腸上皮細(xì)胞系HeP-2的粘附作用;而在HeP-2細(xì)胞系中加入富含粘蛋白Muc2和Muc3的培養(yǎng)基,這兩種菌株就能夠抑制腸致病菌與HeP-2細(xì)胞的粘附,當(dāng)用植物乳桿菌299V與HT-29細(xì)胞系,共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)粘蛋白Muc2和Muc3的mRNA表達(dá)水平提高。表明了這兩株菌對(duì)病原菌的粘附抗性是通過提高腸道粘蛋白Muc2、Muc3表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。雙岐桿菌粘附與腸道粘膜糖蛋白有關(guān)。鄧一平等(2000)用豬胃粘膜糖蛋白與雙岐桿菌及表面分子作用表明,雙岐桿菌在體內(nèi)定植和粘附與其表面分子LTA(脂磷壁酸)、WPG(完整肽聚糖)、PS(多糖)有關(guān)。起主要作用的為L(zhǎng)TA與WPG,它們與胃粘膜糖蛋白粘附性強(qiáng)。FountainLF等(1994)用ELISA方法檢測(cè)了分叉雙岐桿菌對(duì)大鼠腸粘膜提取的粘附素在體外的粘附作用,效果較好。雙歧桿菌的黏附素是一種不耐熱的蛋白質(zhì),腸上皮細(xì)胞上黏附素受體為糖蛋白,與甘露糖有關(guān)(鄭躍杰,1997和1999)。由于腸管各區(qū)段的粘蛋白成分不同,因此不同腸段粘附的有益菌群的種類和數(shù)量不同,這些機(jī)理有可能解釋為什么不同種動(dòng)物不同消化道區(qū)段粘附和定植的菌株的種類和數(shù)量不同。1.2.2雙歧桿菌通過蛋白凝膠特性檢測(cè)細(xì)菌組織中的黏附性有關(guān)研究者對(duì)粘附的分子機(jī)制感興趣,開始對(duì)與粘附相關(guān)的因子進(jìn)行研究。、BernetMarie-Francoise等(1993).以CaCo-2細(xì)胞(具有小腸微絨毛細(xì)胞的某些特性)作為粘附細(xì)胞研究雙岐桿菌與CaCo-2細(xì)胞的粘附機(jī)制,電鏡觀察到粘附發(fā)生在CaCo-2細(xì)胞的頂端刷狀邊緣,細(xì)菌與頂端微絨毛相互作用,而自身沒有被損害,在不依賴Ca2+條件下,整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞和培養(yǎng)上清液中的蛋白質(zhì)類的粘附促進(jìn)物質(zhì),能夠促使雙岐桿菌粘附到CaCo-2細(xì)胞上,而這種蛋白質(zhì)類的粘附促進(jìn)物質(zhì)具有種屬特異性。用激光共距式細(xì)胞儀研究異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的雙歧桿菌1027株對(duì)體外培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞的黏附表明,雙歧桿菌的黏附素是一種不耐熱的蛋白質(zhì),由細(xì)菌分泌至培養(yǎng)液上清中并且從雙歧桿菌1027株上清液中純化出一種相對(duì)分子質(zhì)量為16,000的蛋白質(zhì);光鏡及透射電鏡觀察,雙歧桿菌特異性地黏附于LOVO細(xì)胞的刷狀緣,被黏附的LOVO細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)無破壞(鄭躍杰,1997和1999)。GreeneJeffreyd等(1994)研究表明,乳酸菌株LacidophilusBG2FO4和NCFM/N2的粘附作用能夠被蛋白酶所降低,而乳酸菌株LgasseriADH經(jīng)蛋白酶處理其粘附能力或者沒有被影響,或者被提高,乳酸桿菌物種對(duì)人類腸道細(xì)胞的粘附機(jī)制與細(xì)胞表面不同的碳水化合物或蛋白因素都有關(guān)系,其中乳酸菌株BG2FO4分泌的橋蛋白可能是首要介導(dǎo)的粘附物質(zhì)。GusilsC等(1999)用雞的乳酸菌分離的類似凝集素的蛋白碎片來研究探討其粘附腸道上皮的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)有些種類乳酸桿菌能夠凝集甲戊二醛和甘氨酸處理的酵母細(xì)胞,而用0.2m甘露糖處理時(shí)卻抑制這種凝集反應(yīng)。有些菌株能夠凝集雞紅細(xì)胞,不凝集人的紅細(xì)胞,而對(duì)其它動(dòng)物的紅細(xì)胞的凝集能力不同。利用電泳技術(shù)分析這種凝集素分子量約為50～67kDa。若用脂酶處理,在pH6～7、Ca2+濃度為2mM、Mg2+2mM和37～42℃條件下,能非特異性地增加酵母菌凝集和血凝試驗(yàn)。Dunne等(1999)用蛋白酶處理了唾液乳桿菌ucc118株后,SDS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁表面蛋白中兩個(gè)分子(195kD和83kD)被降解,Western-blotting測(cè)定證實(shí),195kD蛋白與粘附性相關(guān),因此細(xì)菌與腸上皮的細(xì)胞的粘附可能通過表面蛋白的配體受體識(shí)別結(jié)合。在雞的三個(gè)種屬乳酸桿菌中檢測(cè)粘附?jīng)Q定因素時(shí)認(rèn)為,細(xì)菌的粘附主要受靜電作用、疏水空間力、脂磷壁酸和特殊的結(jié)構(gòu)(外在的凝集素和胞外多聚體)的影響,乳酸桿菌株(L.fermentum和L.fermentum.ssp.cellobiosus)細(xì)胞表面具有類似凝集素的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),而乳酸菌株fermentumsspcellobiosus表面具有高度疏水作用,而只有動(dòng)物乳酸菌表面具有核糖醇,磷壁酸(GusilsC等,2002)。Nousiainenandsetala(1998)研究結(jié)果也表明,乳酸桿菌利用胞外物質(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)、脂類和脂磷壁酸可粘附到腸壁上。不同菌株的細(xì)胞壁中多糖濃度不同,菌株L.fermentum.ssp.cellobiosus細(xì)胞壁中多糖濃度最高,而從乳酸桿菌中提取的凝集素不具有糖殘基,表明不同菌系表面結(jié)構(gòu)中都具有類似蛋白質(zhì)的物質(zhì)存在。乳酸桿菌具有不同的表面分子,這些表面分子能夠使乳酸桿菌和腸道上皮細(xì)胞作用。2影響微生物復(fù)制和繁殖的因素2.1酸性ph環(huán)境對(duì)乳酸桿菌溶液溶液溶液流變性的影響GreeneJeffreyd等(1994)研究指出在菌株培養(yǎng)上清液中的小分子量熱穩(wěn)定性的非蛋白因子——酸性pH環(huán)境對(duì)乳酸桿菌粘附人CaCo-2細(xì)胞的效果有影響,能夠改變CaCo-2細(xì)胞本身,使乳酸桿菌對(duì)其粘附性增強(qiáng)。2.2鈣獨(dú)立系統(tǒng)Kleeman和Klaenhammer(1982)研究發(fā)現(xiàn)腸道乳酸菌的粘附有兩種不同的機(jī)理,一種是需要鈣的非特異性系統(tǒng),另一種是鈣獨(dú)立系統(tǒng)。鈣獨(dú)立系統(tǒng)中有兩種乳酸菌成分參與了乳酸菌的粘附,一種成分是抗蛋白酶(與菌體表面有關(guān)),另一種是熱穩(wěn)定的胞外蛋白,該蛋白對(duì)蛋白酶敏感。葉桂安等(1997)在比較雙歧桿菌和致病菌對(duì)體外腸上皮細(xì)胞LOVO細(xì)胞株黏附的鈣信號(hào)傳遞差異研究中發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌黏附能引起LOVO細(xì)胞內(nèi)鈣離子隨時(shí)間延長(zhǎng)而梯度升高,這主要是源于細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流,可能是其作為生理性細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞和諧共生的信號(hào)傳遞基礎(chǔ)。2.3對(duì)腸道黏膜的黏附菌株倫永志等(2000和2003)觀察滅活的青春雙歧桿菌DM8504菌株對(duì)人大腸癌細(xì)胞系CCL-229的黏附時(shí)發(fā)現(xiàn),滅活的雙歧桿菌可能具有與活菌相同的生態(tài)效應(yīng);并且滅活的該菌株對(duì)腸致病性大腸艾希菌(EP