精粗比對(duì)飼糧中霉素微生物凈合成量和亞急性瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

精粗比對(duì)飼糧中霉素微生物凈合成量和亞急性瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

為了提高動(dòng)物的生產(chǎn)效率，高純度飼料的主要能源是淀粉，這會(huì)增加亞甲基高血壓的發(fā)病率?？刂茖?duì)腫瘤胃酸中毒的傳統(tǒng)治療措施主要是控制飼料中顆粒和其他精料的比例，添加碳酸鈉等堿性物質(zhì)，并添加莫拉西泮等抗生素以抑制腫瘤胃微生物的鈉胺生產(chǎn)。然而，碳酸鈉只能暫時(shí)緩解酸中毒，而許多抗生素會(huì)抑制纖維分解菌對(duì)粗素的分解并產(chǎn)生安全問(wèn)題。因此，有必要探索一種安全有效的緩解腫瘤和胃酸堿性疾病的方法。最新的一些研究表明:瘤胃微生物硫胺素代謝與瘤胃酸中毒有密切關(guān)系,向高精料飼糧中添加硫胺素能提高瘤胃液pH,降低乳酸、組胺及內(nèi)毒素濃度,以緩解瘤胃酸中毒。而瘤胃酸中毒得以緩解的根本原因是瘤胃微生物中乳酸利用菌和乳酸產(chǎn)生菌的比例逐漸恢復(fù)平衡,但有關(guān)硫胺素調(diào)控瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本試驗(yàn)旨在采用人工瘤胃法研究不同精粗比飼糧對(duì)硫胺素微生物凈合成量的影響,以及添加硫胺素對(duì)體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)和菌群結(jié)構(gòu)的影響,以期揭示硫胺素緩解亞急性瘤胃酸中毒的根本原因,為硫胺素在反芻動(dòng)物中的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1亞急性瘤胃羧酸誘導(dǎo)成功的試驗(yàn)為了減少體外直接誘導(dǎo)亞急性瘤胃酸中毒及體內(nèi)飼糧因素造成的影響,本試驗(yàn)采用體內(nèi)初步誘導(dǎo)奶牛發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒與體外培養(yǎng)相結(jié)合的研究方法。試驗(yàn)選用3頭安裝永久性瘤胃瘺管、體重為(650±20)kg、平均日產(chǎn)奶量為(16.5±0.5)kg、身體健康狀況良好的4歲齡荷斯坦奶牛。每天于06:00和18:00按奶牛體重2%的干物質(zhì)量等量飼喂,自由飲水。試驗(yàn)分為4期,每期飼喂10d,依次飼喂精粗比為40∶60、50∶50、60∶40、70∶30的試驗(yàn)飼糧,經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)第4期飼喂結(jié)束后亞急性瘤胃酸中毒誘導(dǎo)成功。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。1.2外部試驗(yàn)方法1.2.1振蕩水浴鍋和具3孔出氣口的三角燒瓶參照Menke等的方法安裝人工瘤胃裝置,由恒溫振蕩水浴鍋和具3孔(進(jìn)氣口、出氣口及采樣通道)橡皮塞的250mL三角燒瓶組成。三角燒瓶用橡皮塞塞好后,調(diào)節(jié)氣體流量,使其在39℃條件下培養(yǎng)。1.2.2牛奶瘤胃瘺管的制備于第4期結(jié)束后次日晨飼前采集瘤胃液用于體外培養(yǎng)。在晨飼前,利用自制真空負(fù)壓裝置,通過(guò)奶牛瘤胃瘺管從3頭奶牛瘤胃內(nèi)各采取250mL的瘤胃液,經(jīng)4層紗布過(guò)濾,將濾液裝于事先通有CO2的滅菌生理鹽水瓶中,混合均勻,于39℃水浴保溫。人工唾液鹽參照Menke等的方法于使用的前1天配制,按照2∶1的比例將人工唾液鹽和瘤胃液混合制備體外發(fā)酵液。1.2.3精粗比和添加量將粉碎的濾紙纖維素、羧甲基纖維素、果膠、木聚糖、小麥淀粉和可溶性淀粉按表2所列比例配制成精粗比分別為40∶60、50∶50、60∶40和70∶30的4種半純合飼糧,作為4個(gè)時(shí)期體外培養(yǎng)的底物,底物添加量為2g。1.2.4模型優(yōu)化根據(jù)本課題組前期硫胺素添加水平和體外培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果,確定硫胺素的最佳添加量為180mg/kg。試驗(yàn)采用2×4因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素1為硫胺素添加水平,設(shè)0和180mg/kg2個(gè)水平;因素2為底物精粗比,設(shè)4個(gè)水平,分別為40∶60、50∶50、60∶40、70∶30。試驗(yàn)共設(shè)8個(gè)處理,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),于體外培養(yǎng)0、3、6、9和12h后采集培養(yǎng)液用于各指標(biāo)的測(cè)定。1.3指標(biāo)的測(cè)量和方法1.3.1微生物凈合成量的測(cè)定參照董淑紅的方法,采用熒光分光光度法測(cè)定未添加硫胺素時(shí)不同精粗比飼糧條件下各采樣時(shí)間點(diǎn)(0、3、6、9、12h)培養(yǎng)液中硫胺素的含量,3、6、9、12h時(shí)培養(yǎng)液中硫胺素的微生物凈合成量表示為相對(duì)于0h的增加量。1.3.2腫瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定培養(yǎng)液pH的測(cè)定采用雷磁pHS-3C型pH計(jì)于采樣后立即測(cè)定,培養(yǎng)液中乳酸濃度的測(cè)定參照文獻(xiàn)的方法。1.3.3pcr反應(yīng)體系及參數(shù)對(duì)體外培養(yǎng)9h的培養(yǎng)液中的細(xì)菌進(jìn)行定量。瘤胃細(xì)菌基因組DNA的提取采用反復(fù)凍融法,參照Z(yǔ)hou等的方法進(jìn)行;瘤胃細(xì)菌定量采用PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線法,引物序列見(jiàn)表3。PCR反應(yīng)體系(20μL)如下:10μmol/L的上、下游引物各0.8μL,2×SYBRGreenⅡ10μL,ROXⅡ0.4μL,模板(50ng/μL)2μL,加無(wú)菌水至20μL。PCR反應(yīng)參數(shù)參照TaKaRa試劑盒(DR081A,TaKaRa)說(shuō)明書進(jìn)行。參照呂莉華等的方法構(gòu)建質(zhì)粒,用以驗(yàn)證擴(kuò)增片段的準(zhǔn)確性并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.4dunpan氏法多重比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2003建立數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)SAS9.1.3軟件中的ANOVA模塊進(jìn)行單因素及兩因素方差分析,運(yùn)用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,P<0.05為差異顯著,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或平均值與平均標(biāo)準(zhǔn)誤表示。2結(jié)果2.1不同飼糧精料水平對(duì)硫含量的影響由表4可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),硫胺素的微生物凈合成量呈先降低后升高的趨勢(shì),精粗比為40∶60和50∶50的飼糧組在培養(yǎng)至6h時(shí)其硫胺素微生物凈合成量降至最低,精粗比為60∶40和70∶30的飼糧組在培養(yǎng)至9h時(shí)其硫胺素微生物凈合成量降至最低。隨著飼糧精料水平的增加,硫胺素的微生物凈合成量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在3、6、12h時(shí)常規(guī)飼糧(精粗比為40∶60)組和高精料飼糧(精粗比為70∶30)組差異不顯著(P>0.05),但上述2組在3、9、12h時(shí)均顯著或極顯著低于精粗比為50∶50和60∶40的飼糧組(P<0.05或P<0.01)。此外,高精料飼糧(精粗比為70∶30)組硫胺素的微生物凈合成量在9h時(shí)達(dá)到最低,極顯著低于其他各組(P<0.01),并且相對(duì)于其0h時(shí)的增加量為-0.037μg/mL。2.2飼料中粗素的比例與奶牛外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響2.2.1飼糧精料水平對(duì)培養(yǎng)液ph的影響由表5可知,培養(yǎng)液pH與底物的精粗比有著密切的關(guān)系,除精粗比為50∶50的飼糧組與精粗比為40∶60的飼糧組在3、6、9h時(shí)未達(dá)顯著差異(P>0.05)外,各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液pH均隨飼糧精料水平的增加而極顯著降低(P<0.01),其中精粗比為70∶30的飼糧組在6、9、12h時(shí)的培養(yǎng)液pH均低于5.70,達(dá)到輕度亞急性瘤胃酸中毒狀態(tài)。在體外培養(yǎng)3~12h的時(shí)間段內(nèi),飼糧中添加硫胺素可極顯著提高培養(yǎng)液pH(P<0.01)。此外,各組培養(yǎng)液pH均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。2.2.2精粗比和正交比對(duì)實(shí)驗(yàn)中乳酸濃度的影響由表6可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,各組培養(yǎng)液中乳酸濃度均呈先上升后降低,至12h時(shí)又有所升高的趨勢(shì)。在3h時(shí),精粗比為70∶30的飼糧組培養(yǎng)液中乳酸濃度極顯著高于其他3組(P<0.01);在6~12h時(shí),精粗比為60∶40和70∶30的飼糧組培養(yǎng)液中乳酸濃度均極顯著高于精粗比為40∶60的飼糧組(P<0.01)。在3、9h時(shí),飼糧添加硫胺素可極顯著降低培養(yǎng)液中乳酸濃度(P<0.01),但在其他時(shí)間點(diǎn)飼糧添加硫胺素對(duì)培養(yǎng)液中乳酸濃度的影響差異不顯著(P>0.05)。2.3飼料中粗素的比例與奶牛外包酶菌群結(jié)構(gòu)的影響2.3.1種引物pcr檢測(cè)結(jié)果以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板擴(kuò)增各目標(biāo)片段,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,牛鏈球菌、溶纖維丁酸弧菌、埃氏巨型球菌、反芻獸新月單胞菌、乳酸桿菌目標(biāo)片段常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖知,每種引物實(shí)際擴(kuò)增片段大小與預(yù)期的目的片段大小相符。將這5種PCR產(chǎn)物回收、克隆、構(gòu)建重組質(zhì)粒測(cè)定,并對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)定,測(cè)序結(jié)果與GenBankBlast進(jìn)行序列同源性分析,與標(biāo)準(zhǔn)菌株相似性均在95%以上,克隆的片段含有完整的引物對(duì)序列,說(shuō)明質(zhì)粒構(gòu)建成功,可以用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.3.2反充肉菌共混母菌3.由ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的軟件自動(dòng)生成質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增反應(yīng)曲線。繪制出的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為:牛鏈球菌,Y=-3.05X+36.25,R2=0.996;溶纖維丁酸弧菌,Y=-3.35X+36.77,R2=0.985;埃氏巨型球菌,Y=-2.99X+42.51,R2=0.930;反芻獸新月單胞菌,Y=-2.93X+36.25,R2=0.993;乳酸桿菌,Y=-3.18X+37.45,R2=0.987。其中X表示拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),Y表示Ct值。5對(duì)引物的擴(kuò)增效率均在0.9~1.2的范圍內(nèi),所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合PCR定量的要求。2.3.3飼糧精粗比對(duì)養(yǎng)養(yǎng)液中其他高效菌種的培養(yǎng)影響由表7可知,隨著底物精料水平的增加,培養(yǎng)液中牛鏈球菌和乳酸桿菌的數(shù)量呈增加趨勢(shì),而培養(yǎng)液中埃氏巨型球菌的數(shù)量則呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。其中,精粗比為60∶40和70∶30的飼糧組培養(yǎng)液中牛鏈球菌和乳酸桿菌的數(shù)量極顯著高于精粗比為40∶60和50∶50的飼糧組(P<0.01);精粗比為50∶50和60∶40的飼糧組培養(yǎng)液中埃氏巨型球菌的數(shù)量極顯著高于精粗比為40∶60和70∶30的飼糧組(P<0.01)。飼糧精粗比對(duì)培養(yǎng)液中溶纖維丁酸弧菌和反芻獸新月形單胞菌的數(shù)量未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。添加硫胺素可極顯著地降低培養(yǎng)液中牛鏈球菌的數(shù)量(P<0.01),并極顯著地提高埃氏巨型球菌的數(shù)量(P<0.01),但對(duì)乳酸桿菌、溶纖維丁酸弧菌和反芻獸新月單胞菌的數(shù)量未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。3討論3.1不同給藥劑量對(duì)高精料飼料對(duì)乳狀液中尿素合成的影響硫胺素主要通過(guò)其活性物質(zhì)焦磷酸硫胺素(TPP)的形式發(fā)揮其生理功能。TPP是丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體和轉(zhuǎn)酮醇酶的輔酶,參與糖酵解、檸檬酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑的非氧化分支。在正常飼喂條件下,反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)微生物合成的硫胺素能夠滿足動(dòng)物的需要,但在高精料飼喂條件下或特殊的生理狀態(tài)下,反芻動(dòng)物有可能缺乏硫胺素。Abbas等研究了駱駝不同生理時(shí)期血液中硫胺素含量的變化,發(fā)現(xiàn)非泌乳期、非妊娠期的駱駝血液內(nèi)硫胺素含量顯著高于其他生理階段,泌乳期血液硫胺素含量顯著降低。硫胺素的缺乏會(huì)降低轉(zhuǎn)酮醇酶活性,增加紅細(xì)胞中TPP水平,當(dāng)TPP水平增量超過(guò)45%時(shí)就可能與硫胺素缺乏有關(guān)。Karapinar等通過(guò)測(cè)定奶牛血液中TPP水平以研究在高精料飼喂條件下奶牛是否缺乏硫胺素,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高精料飼喂組血液中TPP水平顯著高于對(duì)照組(47.2%vs.19.53%),這說(shuō)明在高精料飼喂條件下奶牛缺乏硫胺素。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在精粗比為70∶30的高精料飼喂條件下硫胺素的微生物凈合成量顯著降低,但與精粗比為40∶60的常規(guī)飼糧相比,精粗比在50∶50和60∶40條件下硫胺素的微生物凈合成量又顯著升高,其原因可能是精粗比為40∶60的常規(guī)飼糧的能量水平相對(duì)較低,適當(dāng)?shù)奶岣呔纤娇纱龠M(jìn)瘤胃微生物合成硫胺素;但在精粗比為70∶30的高精料飼喂條件下,碳水化合物代謝所需的硫胺素增加,同時(shí)由于pH的降低導(dǎo)致瘤胃菌群結(jié)構(gòu)失衡,致使分解硫胺素的硫胺素酶合成量增加,使得硫胺素降解量增加。此外,硫胺素的合成量與短鏈脂肪酸和丙酸的含量呈正相關(guān),而主要的丙酸產(chǎn)生菌是反芻獸新月單胞菌和埃氏巨型球菌,結(jié)合本研究中飼糧精粗比對(duì)埃氏巨型球菌數(shù)量的影響結(jié)果可知,精粗比為50∶50、60∶40的飼糧組其埃氏巨型球菌的數(shù)量顯著高于其他2組,由此推測(cè)埃氏巨型球菌數(shù)量的增加促進(jìn)了硫胺素的合成,而在精粗比為70∶30的高精料組由于培養(yǎng)液pH的改變降低了埃氏巨型球菌數(shù)量,致使硫胺素的微生物合成量下降。因此,高精料飼喂條件下,反芻動(dòng)物體內(nèi)會(huì)缺乏硫胺素,而當(dāng)硫胺素缺乏時(shí),碳水化合物代謝受阻,導(dǎo)致瘤胃乳酸積累,pH下降,最終發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒或急性瘤胃酸中毒。3.2飼料中粗素的比例與奶牛外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響3.2.1未添加尿素對(duì)培養(yǎng)液ph的影響瘤胃液pH是反映瘤胃發(fā)酵狀況的指標(biāo)之一,主要受瘤胃上皮對(duì)揮發(fā)性脂肪酸吸收、食糜外流以及唾液分泌量的影響。由于本試驗(yàn)采用的是體外批次培養(yǎng)法,沒(méi)有瘤胃對(duì)揮發(fā)性脂肪酸的吸收和底物的外流,人工唾液鹽的緩沖能力也會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,導(dǎo)致飼糧中碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)物大量積累,使得各組培養(yǎng)液pH整體上呈不斷下降趨勢(shì),但在3h時(shí),精粗比為40∶60和50∶50飼糧組的pH有所升高,原因可能是體外精料水平的降低使得瘤胃發(fā)酵速度減慢。在本試驗(yàn)中,高精料飼糧(精粗比為70∶30)組在3~12h時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)液的pH均顯著低于常規(guī)飼糧(精粗比為40∶60)組,究其原因可能是由于高精料飼糧組培養(yǎng)底物中有較高的可溶性碳水化合物,其在瘤胃中發(fā)酵速度較快,從而使微生物產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和其他有機(jī)酸的速度加快,而pH的降低又進(jìn)一步促使酸利用菌與酸產(chǎn)生菌間的數(shù)量失衡,致使pH進(jìn)一步降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明,向各飼糧中添加硫胺素均能有效地提高培養(yǎng)液的pH,這與大多數(shù)的研究結(jié)果一致。結(jié)合本試驗(yàn)其他指標(biāo)測(cè)定結(jié)果分析,pH的升高可能是由于硫胺素促進(jìn)了埃氏巨型球菌和反芻獸新月單胞菌的生長(zhǎng),從而促進(jìn)乳酸的分解,同時(shí)硫胺素抑制了牛鏈球菌的增殖而減少了乳酸的生成量,致使乳酸濃度降低。3.2.2乳酸濃度的提高乳酸是碳水化合物代謝的中間產(chǎn)物,由丙酮酸還原而成,瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的乳酸被乳酸利用菌轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸,為反芻動(dòng)物提供能量。但長(zhǎng)時(shí)間飼喂反芻動(dòng)物高精料飼糧時(shí),瘤胃的消化功能會(huì)發(fā)生紊亂,乳酸產(chǎn)生菌與乳酸利用菌的平衡被打破,瘤胃內(nèi)積蓄的乳酸就會(huì)異常升高,將會(huì)導(dǎo)致瘤胃酸中毒。因此,降低乳酸的濃度對(duì)于維持瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和防止瘤胃酸中毒非常重要。張紅偉等以高精料為發(fā)酵底物,體外培養(yǎng)12h后發(fā)現(xiàn)添加硫胺素60、90mg/kg的試驗(yàn)組的乳酸濃度較對(duì)照組分別下降42.2%、33.7%。本試驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn),隨著精料水平的提高,培養(yǎng)液中乳酸濃度上升,添加硫胺素可顯著降低培養(yǎng)液乳酸濃度,其可能原因是精料中易發(fā)酵碳水化合物含量較高,瘤胃中硫胺素的微生物合成量難以滿足碳水化合物代謝的需要,導(dǎo)致碳水化合物代謝受阻,乳酸濃度升高;另外,因飼糧中添加硫胺素可提高瘤胃pH以緩解瘤胃的酸性環(huán)境,并逐漸恢復(fù)乳酸產(chǎn)生菌與乳酸利用菌的平衡,使得硫胺素的增加量要大于硫胺素的減少量,從而滿足了能量代謝的需要,使碳水化合物的降解順利進(jìn)行,減少乳酸的積累。3.3尿素對(duì)酸乳酸桿菌和埃氏型鋼菌種數(shù)量的影響瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的乳酸菌主要包括牛鏈球菌、淀粉分解菌(溶纖維丁酸弧菌)和乳酸桿菌。牛鏈球菌具有很強(qiáng)的利用淀粉產(chǎn)生乳酸的能力。通常,當(dāng)突然飼喂動(dòng)物含高淀粉的精料飼料時(shí)易發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒和pH的降低,致使牛鏈球菌大量快速增殖,當(dāng)pH低于5.75時(shí),該菌體內(nèi)1,6-二磷酸激酶(FDP)、磷酸丙糖和丙酮酸濃度增加,乳酸脫氫酶(LDH)被激活,促使代謝終產(chǎn)物乳酸大量積累。本研究結(jié)果表明,隨著精料水平的提高,牛鏈球菌和乳酸桿菌的數(shù)量逐漸提高,在不添加硫胺素的情況下,70%精料水平組與40%精料水平組相比分別提高了6.31%和5.29%,這與其他研究結(jié)果相似,但對(duì)溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量無(wú)顯著性影響,這與趙培廳等的結(jié)果相反,原因可能是溶纖維丁酸弧菌是一種嚴(yán)格厭氧型革蘭氏陽(yáng)性菌,而本試驗(yàn)采用體外批次培養(yǎng)法,其生長(zhǎng)活性受到抑制。同時(shí),添加硫胺素可極顯著降低牛鏈球菌的數(shù)量,但對(duì)乳酸桿菌和溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量無(wú)顯著影響,該結(jié)果與王洪榮等的研究結(jié)果一致,說(shuō)明硫胺素在一定程度上能夠抑制牛鏈球菌的增殖。結(jié)合本試驗(yàn)中硫胺素對(duì)乳酸濃度和pH影響的試驗(yàn)結(jié)果,出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是硫胺素的添加促進(jìn)了碳水化合物的代謝,減少了丙酮酸的積累,使得乳酸脫