rp-hplc法測定苦木藥材中4-甲氧基-5-羥基鐵肚米酮的含量

rp-hplc法測定苦木藥材中4-甲氧基-5-羥基鐵肚米酮的含量

苦木是苦木科植物苦木的干燥枝條和葉子，以苦食而聞名。具有清熱、除濕、解毒消腫的功效。用于風(fēng)熱、感冒、咽喉痛、濕熱、腹瀉、濕熱、傷害等?？嗄局饕植加谖覈S河流域以南各省區(qū),其中廣東和廣西的山區(qū)資源比較豐富,生長在山坡、山谷及村邊較潮濕處,我國川陜地區(qū)分布也較多,藥源十分豐富。苦木化學(xué)成分主要包括生物堿、苦味素、苦木內(nèi)酯等。作者在對苦木化學(xué)成分進行了系統(tǒng)分離和結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)了4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮是苦木藥材的主要化學(xué)成分,具有顯著的抑菌作用,并且以往文獻中并無簡便的苦木藥材中4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮的含量測定方法,因此,本文把其作為苦木的活性成分,探索了一種簡便的含量測定方法并測定它在不同來源苦木中的含量。由于2010年版中國藥典中還沒有苦木藥材的含量測定項,屬標準缺項藥材,本文所建立的方法將為2015年版中國藥典中苦木的質(zhì)量控制和評價提供參考。1材料、藥品和試劑WatersAlliance2695高效液相色譜儀,包括Waters2487紫外檢測器,Empower色譜工作站;賽多利斯BT25S(max=21g,d=0.01mg)和天東衡HTX1001T型(max=1kg,d=0.1g)電子天平;昆山KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機;美國MILLI-PORE公司超純水發(fā)生器。苦木藥材樣品購自西安萬壽路藥材市場,經(jīng)陜西省生物醫(yī)藥重點實驗室王亞洲副教授鑒定為苦木科植物苦木Picrasmaquassioides(D.Don)Benn.的干燥枝及莖。對照品4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮為實驗室自制,并經(jīng)UV、IR、NMR鑒定結(jié)構(gòu);HPLC檢測,面積歸一化法計算純度,均>99%。甲醇和乙腈為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),冰醋酸為分析純(西安化學(xué)試劑廠),水為超純水(自制,并經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾)。2方法和結(jié)果2.1色譜柱的制備精密稱取4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮4.80mg于20mL量瓶中,以甲醇定容制成對照品溶液,4℃冷藏,備用。精密稱取苦木藥材粉末(過20目篩)約1.0g于具塞三角瓶中,加入甲醇20mL后稱定重量,超聲(400W,40kHz)處理30min,放置至室溫,稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻并靜置后取上清液約1.5mL,微孔濾膜(0.45μm)過濾,即得。色譜柱:WelchromC18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:乙腈-0.1%醋酸水溶液(30∶70);流速:1.0mL·min-1;紫外檢測波長:254nm;柱溫:30℃;進樣量:20μL。2.3儀器精密度與回收率分別取對照品儲備液、供試品溶液各20μL,按“2.2”項下色譜條件測定,記錄色譜圖(見圖1),藥材中其他色譜峰對4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮色譜峰無干擾,理論塔板數(shù)為3136,4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮色譜峰能達到基線分離,峰形對稱,基線平穩(wěn)。分別精密吸取對照品儲備液適量,以甲醇配制成濃度為12.0,24.0,48.0,96.0,144.0,192.0,240μg·mL-1的系列對照品溶液。分別精密吸取上述溶液20μL進樣,以峰面積積分值Y為縱坐標,以進樣濃度X(μg·mL-1)為橫坐標進行線性回歸,結(jié)果4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮回歸方程為:Y=7.617×104X+1.150×105r=0.99994-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮進樣濃度在12.0～240.0μg·mL-1的范圍內(nèi)與峰面積的積分值具有良好的線性關(guān)系。精密吸取對照品溶液20μL,按“2.2”項下色譜條件,連續(xù)進樣6次,測定4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮峰面積值的RSD為0.5%,表明儀器精密度良好。精密稱取1號樣品粉末約1.0g共6份,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.2”項下色譜條件進樣分析,計算樣品4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮峰面積值的RSD為1.2%。說明該方法的重復(fù)性良好。取同一供試品溶液20μL,分別于0,2,4,8,12,24h在上述色譜條件下進樣測定,記錄峰面積。計算樣品中4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮峰面積的RSD為1.3%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。精密稱取已知含量的2號苦木樣品粉末約0.5g,共6份,每份分別加入濃度為32.4μg·mL-1的4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮對照品溶液20mL,按“2.1.2”項下方法制備溶液,按“2.2”項下色譜條件測定,計算回收率(n=6)。結(jié)果4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮的回收率為101.2%,RSD為2.3%。取不同產(chǎn)地的苦木樣品各3份,分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,在上述色譜條件下,每份溶液進樣2次。根據(jù)峰面積值從標準曲線方程計算不同來源苦木藥材中4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮的含量,結(jié)果見表1。3色譜條件的確定本文參考文獻采用210nm為紫外檢測波長,結(jié)果4-甲氧基-5-羥基-鐵屎米酮吸收峰較小,而且溶劑峰及雜峰干擾較大,通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)其在250nm附近有最大吸收,參考文獻決定用254nm作為其檢測波長。采用乙腈-0.1%磷酸水溶液(35∶65)測定苦木藥材中4-甲氧基-5-羥基-鐵屎米酮的含量,結(jié)果4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮與樣品中其他成分分離不夠好,而且峰形較寬,拖尾。實驗又考察了乙腈-0.1%醋酸水溶液(40∶60)、乙腈-0.1%醋酸水溶液(35∶65)、乙腈-0.1%醋酸水溶液(30∶70)以及柱溫(25℃、30℃、35℃)對分離效果的影響,乙腈-0.1%醋酸水系統(tǒng)使其與其他成分達到了基線分離,通過比較不同參數(shù)的色譜圖的分離度、保留時間,得到的最佳色譜條件為:乙腈-0.1%醋酸水溶液(30∶70),流速1.0mL·min-1,柱溫30℃。本文所建立的方法具有良好的精密度和簡便性,適合于測定苦木藥材中4-甲氧基-5-羥基-鐵屎米酮的含量。由表1可見,不同來源的10批樣品中4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮的含量范圍在0.33～4.29mg·g-1,表明不同來源的苦木藥材中4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮的含量變化較大,這可能與植物基原,生長環(huán)境,存儲條件等因素有關(guān)。10份樣品中4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮的含量最高為4.29mg·g-1,最低僅為0.33mg·g-1,4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮的含量限度宜定為不低于0.40mg·g-1。由于本文只抽取了10批