植物病原線蟲種快速分子鑒定

植物病原線蟲種快速分子鑒定

20世紀80年代，生物技術在各個領域得到了廣泛應用，分子診斷也成為植物線蟲研究的一種新形式。直接測定線蟲的遺傳物質(DNA)是潛在的最有力的線蟲診斷工具,因為DNA診斷技術并不依賴于基因組的表達產物,也不受環(huán)境影響和線蟲發(fā)育階段的限制。在植物線蟲的分子診斷和鑒定中,最有價值的基因組區(qū)域之一是核糖體DNA(rDNA)重復單元,rDNA編碼和非編碼區(qū)的比較分析正在成為許多生物的種和亞種鑒定的普遍工具。1pcr擴增植酸酶基因序列在大多真核生物核基因組中,每個重復rDNA基因家簇從5′到3′端的結構是由外轉錄間隔區(qū)(ExternalTranscribedSpacer,ETS)、18S基因、內轉錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacerRegion,ITS)、5.8S基因、28S基因和基因間隔區(qū)(IntergenicSpacer,IGS)6部分組成,IGS區(qū)域連接著另一個rDNA基因家簇的拷貝。ITS序列是一個多用途的遺傳標記,位于18S和28S核糖體DNA基因的重復簇之間,中間被5.8S核糖體DNA基因分開。rDNA是核DNA基因組中度重復簇的一個組分,在基因組中有100~500個拷貝,總長度為7~13kb,且18S、5.8S和28S基因組序列在大多數生物中趨于保守,在生物種間變化小,而內轉錄間隔區(qū)ITS1和ITS2變化較大,基因間隔區(qū)IGS的序列變化最大使生理小種之間差異顯著。這樣就很容易通過PCR擴增更多變異性和分類學上有價值的ITS區(qū)域的片段,使從單條線蟲進行PCR擴增變得簡單易行。通過PCR技術,設計特定的引物對線蟲rDNA的ITS區(qū)進行擴增,然后用限制性內切酶酶切擴增產物,將酶切片段進行多態(tài)性(RFLP)分析,或者用隨機引物擴增,進行全基因組隨機擴增DNA多態(tài)性(RAPD)分析,還可以進行擴增的限制性片段長度多態(tài)性(AFLP)分析。當用“通用”PCR引物擴增時,任何單一線蟲種都能提供ITS區(qū)的擴增產物。因此,任何線蟲種、群體和線蟲群落生態(tài)演替都能用基于rDNAITS區(qū)域的分子途徑來進行分析。當土壤混合群落中含有大量的幼蟲階段、當線蟲的性別是二態(tài)性時,或當遇到不熟悉的線蟲時,標準的分子標記對于線蟲識別特別有用。在生態(tài)學研究中,來源于單頭線蟲的ITS的PCR-RFLP分布圖可能是檢測樣品中線蟲多樣性的一種方法,同時也為線蟲比較和鑒定提供一個標準的、關鍵性的有用分類特征。2rena-has-pcr技術在植物寄生蟲譜的分子診斷中的應用2.1劍線蟲組內群體的結構分析劍線蟲是一類可以傳播植物病毒的線蟲,傳毒效率因種而異。Vrain等最先根據秀麗小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的18S和28S基因序列分析結果設計了一對保守性引物擴增16個美洲劍線蟲(X.americanum)群體rDNA-ITS區(qū),均得到大小約為1500bp的擴增產物,用限制性內切酶AluI、BamHI、DdeI、HinfI、MboI及MspI酶切擴增產物,經RFLP分析揭示了該美洲劍線蟲組內群體的復雜系統(tǒng)分類。Judith等利用劍線蟲rDNA中的18S基因高度保守的特性,用引物INRA擴增來自德國無毒苗栽培的葡萄園中劍線蟲3個種X.index、X.diversicaudatum和X.vuittenezi不同群體的rDNA-ITS區(qū),測序結果顯示這3種劍線蟲的種間變異比較小。同時,他還對來自世界各地的長針科線蟲rDNA的18S進行擴增、測序,很容易地將劍線蟲屬(Xiphinema)和長針線蟲屬(Longidorus)分開,并區(qū)分了X.americanum、X.pachtaicum和其它劍線蟲組內的不同群體,揭示了劍線蟲和長針線蟲的兩個屬的親緣關系,得出Xiphinema和Longidoruscamelliae的親緣關系最近,與L.litchi的親緣關系次之。2.2細胞譜和pcr擴增對子擴增的擴增胞囊線蟲是農業(yè)上一類重要的病原線蟲,根據寄主范圍、形態(tài)學、繁殖方式及染色體數等特征,甜菜胞囊線蟲(H.schachtii)和大豆胞囊線蟲(H.glycine)都歸為甜菜胞囊線蟲組。為了揭示這兩種胞囊線蟲的種間差異,Ferris等擴增了這兩種線蟲rDNA的兩個ITS區(qū),比較了它們核苷酸序列的差異,得出胞囊線蟲屬內的遺傳距離,并用該技術構建了胞囊線蟲的系統(tǒng)進化樹。Subbotin等用通用引物AB28和TW81擴增了胞囊線蟲的25個有效種、一個未知種和一個Meloidoderaalni的ITS區(qū),得到1010bp和1060bp的2種大小的DNA片段,證實了禾谷胞囊線蟲的ITS存在“A”型和“B”型現象,并用26種限制性內切酶酶切擴增產物,結合其中的7種內切酶將這些重要的胞囊線蟲種相互區(qū)分開來。他們也首次描述了一種基于雙倍PCR技術用種特異性引物快速診斷和鑒定大豆胞囊線蟲幼蟲和胞囊的方法,應用兩組引物擴增來自中國、俄羅斯、美國和巴西的52個大豆胞囊線蟲群體的rDNA,第一組引物含有兩個通用引物D3A和D3B,用于28S擴增核糖體基因的D3擴展區(qū)后得到大小約345bp的片段;第二組引物包括大豆胞囊線蟲種特異性引物GlyF1和一個通用引物rDNA2,用于擴增ITS2區(qū)的片段和部分28S基因后得到一個大小約181bp的特異性片段,而且能從大豆胞囊線蟲的單個胞囊或單條2齡幼蟲的微量DNA中擴增出特異性片段,靈敏度很高。Amiri等用兩種引物TW81和AB28擴增甜菜胞囊線蟲的ITS區(qū),并用兩種限制性內切酶MvaI和ScrFI得到的RFLP片段成功區(qū)分了甜菜胞囊線蟲(H.schachtii),H.betae,H.trifolii和H.medicaginis。在中國,已經開展了胞囊線蟲核糖體DNA中ITS區(qū)的研究。彭德良等報道了中國小麥禾谷胞囊線蟲的rDNA-ITS,應用AB28和TW81擴增出1060bp的ITS區(qū)片斷,用HinfI酶切后揭示了中國小麥禾谷胞囊線蟲與摩洛哥禾谷胞囊線蟲群體間的RFLP差異,并且證實了番茄是中國大豆胞囊線蟲的新寄主;鄭經武等報道中國大豆胞囊線蟲群體的rDNA-ITS,用通用引物擴增出1060bp的DNA片斷,ITS區(qū)PCR-RFLP研究表明ITS區(qū)在大豆胞囊線蟲種間是穩(wěn)定的。2.3測序和測序研究根結線蟲的鑒定是植物線蟲分類的重要組成部分,國外已經應用rDNA-ITS區(qū)進行根結線蟲的快速分子診斷和從混合種群中識別根結線蟲種。Blok等用引物5S和引物18S擴增爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、南方根結線蟲、瑪雅圭根結線蟲(M.mayaguensis)和北方根結線蟲的rDNA中18S和5S之間的ITS區(qū)域,從爪哇根結線蟲、花生根結線蟲和南方根結線蟲中擴增出715bp的ITS產物,從瑪雅圭根結線蟲中擴增出831bp的ITS產物,從北方根結線蟲中擴增出的ITS最小,僅為564bp,從而有效地揭示了種內和種間變異Schmitz等用通用引物5367、5368、F194和F195擴增M.chitwoodi、M.fallax、M.hapla、M.incognita、M.javanica、M.naasi群體的rDNA-ITS區(qū),均得到一條大小約760~800bp的片段,然后用17種限制性內切酶酶切擴增產物,用RFLP技術分析了不同種的多態(tài)性片段,并用RAPD技術構建了這些種的遺傳距離圖,有效揭示了根結線蟲種間變異。Waeyenberge等用Tru91酶切比利時根結線蟲群體的ITS擴增產物,成功區(qū)分了M.chitwoodi、M.fallax和M.hapla,并用RAPD技術檢測了這些根結線蟲群體的遺傳距離,構建了親緣關系的系統(tǒng)樹。國內根結線蟲的rDNA研究也剛剛開始,彭德良等用PCR技術對來自中國的10個根結線蟲群體進行rDNA-ITS-RFLP及其序列的研究,應用通用引物F195和5367擴增出一條約700bp的DNA片段,并結合形態(tài)學特征和形態(tài)測量值將這些群體診斷為4個常見種和象耳豆根結線蟲(M.entrolodii)。廖金玲等對根結線蟲的核糖體DNA的ITS區(qū)進行研究,通過對熒光AFLR片段分析和對18S基因組、ITS區(qū)、26S基因組的擴增、克隆、測序一系列分析,成功地鑒定出M.arenaria、M.incognita、M.javanica和最近描述的一個新種M.panyuensis。趙鴻等也用該技術擴增來自中國不同地區(qū)的13個根結線蟲群體并用限制性片段長度多態(tài)性分析,揭示了由于地理條件、氣候、環(huán)境等因素造成我國的M.incognita和M.javanica群體跟巴西、意大利的M.incongnita和M.javanica群體的rDNA-ITS存在異質性。2.4p.niglctus和p.volnus的遺傳相似率短體線蟲是農業(yè)上較重要的一類植物線蟲,Pinochet等用20個引物擴增短體線蟲Pratylenchusvulnus的7個群體,其中6個引物擴增出來的ITS區(qū)產物,經RAPD技術分析可以檢測這7個群體間的變異,同時也成功地鑒定出了P.neglectus與P.vulnus,并測出這兩個種間的親緣率只有0~0.06,而P.vulnus群體間的遺傳相似率高達0.9。Waeyenberge等用保守性引物rDNA1和rDNA2擴增了18種短體線蟲的rDNA-ITS產物,得到約900~1250bp的DNA片段,揭示了在短體線蟲種間ITS的長度和大小差別較大。用5種限制性內切酶CfoⅠ、DdeⅠ、HindⅢ、HpaⅡ、PstⅠ酶切ITS擴增產物,結合至少兩種酶將所有的18種短體線蟲相互區(qū)分開來。Siciliano-Wilcken等用rDNA-ITS-RAPD技術成功區(qū)分了來自巴西加啡、香蕉、柑桔、觀賞植物上的短體線蟲P.coffeae和P.penetrans的不同群體。2.5植松材線蟲和擬松材線蟲的重新擴增pcr廖金玲等用rDNA-ITS-PCR擴增松材線蟲和擬松材線蟲的rDNA的ITS區(qū),分別得到大小約為220bp和330bp的DNA片段,有效揭示了這兩種線蟲ITS的大小和變異。張立海等用兩個引物擴增松材線蟲和擬松材線蟲的rDNA-ITS區(qū),得到ITS1區(qū)的擴增產物大小約308bp,該區(qū)可作為松材線蟲PCR鑒定的靶序列,并且測出這兩個種間的ITS差異很大(為32~39bp),而松材線蟲種內差異很小(不超過1bp)。鄭經武等也得出了相同的結論:他們用5種限制性內切酶AluⅠ、CfoⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ酶切松材線蟲和擬松材線蟲(B.mucronatus)的rDNA-ITS區(qū)擴增產物,經RFLP分析得到的特異性譜帶,成功檢測出了來自寧波的這兩種線蟲,并且檢測出它們的種間差異大,而種內差異很小。2.6胞囊線蟲遺傳關系和親緣關系研究馬鈴薯金線蟲(G.rostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(G.pallida)是馬鈴薯的主要病原物,快速準確鑒定這兩種線蟲及其小種是包括檢疫措施在內的綜合防治馬鈴薯胞囊線蟲病的基礎。Fleming等應用Vrain設計的引物擴增G.rostochiensis和G.pallida的ITS區(qū)并用PCR-RFLP揭示了種內和種間變異,這一途徑已擴展至測定馬鈴薯金線蟲、馬鈴薯白線蟲和煙草胞囊線蟲復合種和其它球胞囊線蟲種的相關性。Ferris等對球胞囊線蟲屬中5個種的rDNA-ITS區(qū)進行擴增、序列分析,明確了5個種之間的親緣關系。Subbotin等擴增了5種胞囊線蟲rDNA的28S基因的D3擴展區(qū)和ITS1-5.8S-ITS2區(qū),結果發(fā)現G.rostochiensis和G.pallidaD3擴展區(qū)的核苷酸序列相同,并用RFLP分析成功區(qū)分了來自南美茄科植物上的3種胞囊線蟲G.rostochiensis、G.tabacum、G.pallida和1個未描述的種,同時構建了遺傳上親緣關系的系統(tǒng)樹。Zouhar等用PCR擴增技術,經RFLP、RAPD、SSCP分析成功區(qū)分了來自捷克的5個G.rostochiensis群體和3個G.pallida群體。2.7pcr擴增d.dipsaci產物的生物活性鱗球莖莖線蟲(D.dipsaci)、馬鈴薯腐爛莖線蟲(D.destructor)和食菌莖線蟲(D.myceliophagus)是重要的植物寄生線蟲,在分類鑒定上比較困難。Wendt等用保守性通用引物rDNA1和rDNA2從D.myceliophagus和D.dipsaci中擴增出約900bp的DNA片段,從D.destructor中擴增出約1200bp的ITS產物。Zouhar等用通用引物擴增D.dipsaci的ITS區(qū)(引物是由Caenorhabditis