分子生物學(xué) 常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室劉興漢分子生物學(xué)

MOLECULARBIOLOGY常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理

DNA變性：

雙鏈DNA在各種理化因素作用下變?yōu)閱捂湹倪^程。本質(zhì)是堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂。DNA復(fù)性：

去除變性條件，變性DNA重新形成雙鏈的過程。常用變性條件：

加熱分子雜交：

不同來源的單鏈核苷酸鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)原則形成雜種雙鏈的過程。分子雜交的目的：

檢測DNA和RNA

探針：

分子雜交中和待測核苷酸鏈堿基互補(bǔ)的被標(biāo)記的核苷酸鏈。堿基對(duì)間氫鍵探針待測DNA或RNA增色效應(yīng)：

DNA變性伴隨260nm吸收值增高減色效應(yīng)：

DNA復(fù)性伴隨260nm吸收值降低原因：

鹼基中共軛雙鍵的暴露Tm值:分子雜交的方法:（固—液雜交）

1.斑點(diǎn)雜交：

提取DNA或RNA，直接點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，和探針雜交

檢查有沒有你所要的DNA或RNA硝酸纖維素膜待測DNA或RNA

雜交液探針1234SlotblotDotblot反向斑點(diǎn)雜交

固相：多種探針序列

液相：一種待測樣品(標(biāo)記）

DNA點(diǎn)陣：

將多種探針序列成排的點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，檢測DNA或RNA和那一個(gè)探針雜交。待檢樣品進(jìn)行標(biāo)記一種樣品多種探針多種探針序列標(biāo)記待測核酸基因芯片：

將更多的探針排列在硅片上，借助計(jì)算機(jī)檢測未知的DNA或RNA和那一個(gè)探針雜交2.原位雜交

組織固定技術(shù)與分子雜交技術(shù)結(jié)合

組織切片或細(xì)胞涂片原位雜交：

將DNA或RNA在組織切片和細(xì)胞涂片中變性和固定，和探針雜交確定DNA或RNA在組織和細(xì)胞中的定位。

菌落或噬菌斑原位雜交：

基因工程中篩選陽性克隆。

3.轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)電泳技術(shù)與分子雜交技術(shù)結(jié)合電泳結(jié)果從凝膠轉(zhuǎn)移到固相膜上，稱之為blotting膜上樣品再與探針雜交樣品中哪一個(gè)是目標(biāo)ＤＮＡ或ＲＮＡ轉(zhuǎn)移印跡實(shí)驗(yàn)①②③放射自顯影照片—＋濾紙凝膠硝酸纖維膜印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用

WesternBlotting常被用來檢測基因表達(dá)12341.正常細(xì)胞2.正常細(xì)胞/凋亡素3.腫瘤細(xì)胞4.腫瘤細(xì)胞/凋亡素細(xì)胞核內(nèi)的熱休克蛋白70

1234第二節(jié)核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的基本原理：化學(xué)裂解法

(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法

(Sanger法)FrederickSanger蛋白質(zhì)測序技術(shù)獲１９５８年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)ＤＮＡ測序技術(shù)獲１９８０年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)一、DNA鏈末端合成終止法運(yùn)用ＤＮＡ復(fù)制的原理底物中加入雙脫氧核糖核苷酸合成引物用同位素標(biāo)記鏈末端合成終止法測定DNA序列的原理負(fù)極5′3′合成鏈模板鏈ddG

ddA

ddT

ddCCGGCTAGCTAATCGCGGCTATA5′3′正極二、DNA自動(dòng)測序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同顏色熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸合成時(shí)分4管分別合成，電泳時(shí)4管產(chǎn)物混合一起電泳后，通過四種激光激發(fā)熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。第三節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)PolymeraseChainReactionKaryBanksMullis1983年27歲發(fā)明PCR技術(shù)

1993年獲諾貝爾獎(jiǎng)5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理5

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Cycle35

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?CPCR是體外DNA復(fù)制過程，最原始的目的是擴(kuò)增DNA.RNA可以經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為DNA,再用PCR擴(kuò)增（二）目的基因的克隆cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因真核基因在原核表達(dá)時(shí)用RT-PCR擴(kuò)增mRNA二、PCR技術(shù)的主要用途（一）微量DNA和RNA的擴(kuò)增利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。

（三）基因突變TGC將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。（四）DNA序列測定（五）基因突變分析逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄法方案：AAnATTnT5′5′mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′

3′5′

5′加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶重復(fù)上述步驟擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物PCR用于檢測在mRNA水平上的基因表達(dá)差異要防止擴(kuò)增效率不同產(chǎn)生的誤差要管家基因作內(nèi)對(duì)照原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)固定組織或細(xì)胞蛋白酶K消化處理PCR擴(kuò)增原位雜交顯微鏡觀察結(jié)果基本方法（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)時(shí)PCR(real-timePCR)又稱熒光定量PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，最后通過外標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ定量PCR示意圖5’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’4.Detection5’3’3’QTaqR5’lR定量PCR示意圖反向PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR原位PCR重組PCR不對(duì)稱PCR多重PCRPCR衍生技術(shù)錨定PCR巢式PCR免疫PCR連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)時(shí)PCR遞減PCR

第四節(jié)基因文庫GeneLibrary基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)

基因文庫(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫的載體有

噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。

二、cDNA文庫基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選第五節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique一、生物芯片的概念

指通過微電子、微加工技術(shù)在平方厘米大小的固相介質(zhì)表面構(gòu)建的微型分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)組織細(xì)胞中DNA、蛋白質(zhì)及其他生物組分的快速、高效、敏感地處理與分析。生物芯片（biochip）信息芯片：

將與生命相關(guān)的信息分子高度集成，來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因、蛋白等生物活性物質(zhì)進(jìn)行高通量的檢測與分析基因芯片（DNA芯片）蛋白質(zhì)芯片組織芯片細(xì)胞芯片功能芯片（微流體芯片）

在芯片上完成生命科學(xué)研究中樣品的分離、擴(kuò)增、生化反應(yīng)等功能

生物樣品制備芯片核酸擴(kuò)增芯片毛細(xì)管電泳芯片將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交用熒光檢測系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。

一、基因芯片基因芯片(genechip)基因芯片工作流程示意圖生物戰(zhàn)劑檢測

臨床疾病的基因診斷法醫(yī)學(xué)鑒定藥物研究開發(fā)動(dòng)植物檢疫

基因組研究后基因組計(jì)劃生物信息學(xué)基因芯片基因芯片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒏叨让芗帕械牡鞍追肿幼鳛樘结橖c(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。

標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖(二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途

酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域BDAD組件式：結(jié)構(gòu)可互相分開功能互相獨(dú)立空間較近時(shí)表現(xiàn)活性中間序列對(duì)活性無影響報(bào)告基因

在GAL4結(jié)合的順式作用元件下游需連接報(bào)告基因。

目前應(yīng)用最多的報(bào)告基因是LacZ基因，表達(dá)后能在X-Gal培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落。

其次是His基因，表達(dá)后能使酵母菌在缺少組氨酸的培養(yǎng)基中生長。

現(xiàn)在多提倡兩種報(bào)告基因同時(shí)應(yīng)用，顏色篩選和營養(yǎng)缺陷篩選同時(shí)進(jìn)行，以降低假陽性的出現(xiàn)

表達(dá)電泳遷移率變動(dòng)測定(EMSA)或稱凝膠遷移變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(gelshiftassay)用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動(dòng)測定放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標(biāo)記探針1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未標(biāo)記探針10X凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖遺傳修飾動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel

第七節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。

轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)——目的基因的受體動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)核轉(zhuǎn)移技術(shù)

即動(dòng)物整體克隆技術(shù)，將動(dòng)物的一個(gè)體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的的激活的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆(clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)基因剔除技術(shù)(geneknockout)

也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)

基因剔除操作過程與機(jī)制1.構(gòu)建基因打靶載體2.將重組載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞

將重組載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞中靶的ES細(xì)胞移入胚泡，胚泡植入子宮，篩選嵌合體小鼠

建立動(dòng)物模型①單基因決定疾病模型基因剔除獲得性突變(gain-of-functionmutation)②多基因決定疾病模型四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的作用第八節(jié)疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候選基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)定義

通過對(duì)一種致病基因功能的了解來克隆該致病基因。（一）功能克隆應(yīng)用

生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到純化的遺傳性疾病。利用蛋白質(zhì)的表達(dá)及功能信息抗原抗體反應(yīng)提純蛋白質(zhì)制備抗體建立cDNA文庫陽性克隆提取重組體篩選測序氨基酸序列信息：氨基酸序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針（簡并密碼）cDNA文庫陽性克隆序列分析篩選提取重組體利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。用不同人的DNA片段轉(zhuǎn)化與人類遺傳疾病具有類似表型的突變酵母可以恢復(fù)(rescue)正常表型的片段中所含有的基因即可能為致病基因這種實(shí)驗(yàn)稱為功能互補(bǔ)試驗(yàn)(functionalcomplementationassay)。表型與人類疾病相似的酵母突變株表型恢復(fù)正常人類正?；颍ǘ┒ㄎ豢寺《x從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作①

遺傳學(xué)分析(確定致病基因染色體定位)交換分析、連鎖不平衡分析②分子生物學(xué)分析將病人的DNA和正常人的DNA進(jìn)行雜交，去除相同部分，剩余部分既是致病基因利用基因在染色體位置的信息杜氏肌營養(yǎng)不良致病基因的定位克?。?/p>

遺傳學(xué)家族連鎖分析將致病基因定位于Xp21

病人Ｘ染色體和正常人X染色體雜交，去除能雜交的ＤＮＡ片段正常染色體上不能雜交的片段既是致病基因（三）非定位候選基因克隆策略

由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對(duì)各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測出候選致病基因。根據(jù)致病基因的可能功能，檢測因特網(wǎng)基因庫中的基因功能區(qū)將含有接近功能域的基因用于致病的改變檢測。（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因?；蛟\斷和基因治療第九節(jié)GeneDiagnosisandGeneTherapy基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常外源基因的入侵

特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng)特異性強(qiáng)靈敏度高

適應(yīng)性強(qiáng)基因診斷的概念和特點(diǎn)定義利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法?；蛟\斷常用技術(shù)方法（二）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)（三）基因測序（四）基因芯片（五）連鎖分析（一）核酸分子雜交技術(shù)疾病相關(guān)遺傳標(biāo)志的連鎖分析連鎖：同一條染色體上位置相鄰的基因被一起遺傳而沒有發(fā)生重組。連鎖分析：利用與致病基因相連的某些基因作為遺傳標(biāo)志，通過鑒定遺傳標(biāo)志的存在判斷個(gè)體是否帶有致病基因。連鎖分析無需了解致病基因的結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制，適用于由未知基因缺陷引起的遺傳性疾病間接診斷：沒有直接檢測致病基因無重組發(fā)生重組用于連鎖分析的遺傳標(biāo)志

1.不同個(gè)體之間存在高度的多態(tài)性多態(tài)性：在一個(gè)特定的基因座位上存在兩個(gè)以上的等位基因，其中的任何一個(gè)等位基因在群體中的頻率大于1%。2.需要獲得足夠的家系成員樣本。3.致病基因和標(biāo)志基因連鎖，兩個(gè)基因的距離越近越好。限制性片段長度多態(tài)性

限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定DNA序列并在此序列內(nèi)切斷DNA

單個(gè)鹼基突變可丟失或獲得限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)切割片段長度不同，電泳分開限制性片段長度多態(tài)性與致病的基因連鎖分析GAATTCCTTAAGGAATTTCTTAAARLFP分析法×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正常基因5′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶者患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。

正常人純合突變雜合突變Leber

病患者PCR/SSCP分析+﹣短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）

人類基因組25%為重復(fù)序列衛(wèi)星DN