生物化學(xué)常用緩沖液

緩沖溶液

緩沖溶液是一類能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持pH值基本不變的溶液。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶液，溶液內(nèi)所溶解的溶質(zhì)（化合物）稱之為緩沖劑，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比即可制得不同pH的緩沖液。

緩沖溶液的正確配制和pH值的準(zhǔn)確測定，在生物化學(xué)的研究工作中有著極為重要的意義，因?yàn)樵谏矬w內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的pH值下進(jìn)行的，而且受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控，能夠做到這一點(diǎn)是因?yàn)樯矬w內(nèi)有完善的天然緩沖系統(tǒng)。生物體內(nèi)細(xì)胞的生長和活動需要一定的pH值，體內(nèi)pH環(huán)境的任何改變都將引起與代謝有關(guān)的酸堿電離平衡移動，從而影響生物體內(nèi)細(xì)胞的活性。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有體內(nèi)過程完全相同的pH值，此外，各種生化樣品的分離純化和分析鑒定，也必須選用合適的pH值，因此，在生物化學(xué)的各種研究工作中和生物技術(shù)的各種開發(fā)工作中，深刻地了解各種緩沖試劑的性質(zhì)，準(zhǔn)確恰當(dāng)?shù)剡x擇和配制各種緩沖溶液，精確地測定溶液的pH值，就是非常重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)工作。下表列出某些人體體液的pH值：體液pH

體液pH

血清7.35～7.45

大腸液8.3～8.4

成人胃液0.9～1.5

淚6.6～6.9

唾液6.3～7.1

尿4.8～7.5

胰液7.5～8.0

腦脊液7.35～7.451960年，N.E.Good和他的同事們提出，適合生命科學(xué)研究使用的緩沖體系應(yīng)具有以下特性：

①pKa值在6～8之間；②在水中的溶解度高；③不易穿透生物膜；④鹽效應(yīng)??；⑤離子濃度、溶液組成和溫度對解離的影響??；⑥不與金屬離子生成復(fù)合物或沉淀；⑦該緩沖劑化學(xué)穩(wěn)定；⑧紫外和可見光波長范圍內(nèi)光吸收小；⑨易制得高純度的鹽。

按照這些要求可以設(shè)計和選擇最為合適的緩沖劑來配制所需的緩沖溶液。

生物化學(xué)常用緩沖液

⑴磷酸鹽緩沖液

磷酸鹽是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是二級解離，有二個pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬：

NaH2PO4：pKa1＝2.12，pKa2＝7.21

Na2HPO4：pKa1＝7.21，pKa2＝12.32

配酸性緩沖液：用NaH2PO4，pH＝1～4，

配中性緩沖液：用混合的兩種磷酸鹽，pH＝6～8，

配堿性緩沖液：用Na2HPO4，pH＝10～12。

用鉀鹽比鈉鹽好，因?yàn)榈蜏貢r鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時，只能用磷酸鈉而不能用磷酸鉀，因?yàn)镾DS（十二烷基硫酸鈉）會與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸鉀。

磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：①容易配制成各種濃度的緩沖液；②適用的pH范圍寬；③pH受溫度的影響??；④緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋十倍后pH的變化小于0.1。

其缺點(diǎn)為：①易與常見的鈣Ca++離子、鎂Mg++離子以及重金屬離子締合生成沉淀；②會抑制某些生物化學(xué)過程，如對某些酶的催化作用會產(chǎn)生某種程度的抑制作用。

⑵Tris（三羥甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）緩沖液Tris緩沖液在生物化學(xué)研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩沖液的趨勢，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。

Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如：

Tris-HCl緩沖液：

pH＝7.5～8.5

Tris-磷酸鹽緩沖液：pH＝5.0～9.0

配制常用的緩沖液的方法有兩種：①按書后附錄中所列該緩沖液表中的方法，分別配制0.05mol/LTris和0.05mol/LHCl溶液，然后按表中所列體積混合。由于標(biāo)準(zhǔn)濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一種方法；②若配1L0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液：先稱12.11gTris堿溶于950mL～970mL無離子水中，邊攪拌邊滴加4NHCl，用pH計測定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水補(bǔ)足到1L。

Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是：①因?yàn)門ris堿的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；②對生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。其缺點(diǎn)是：①緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋十倍，pH值的變化大于0.1；②溫度效應(yīng)大，溫度變化對緩沖液pH值的影響很大，即：△pKa／℃＝－0.031，例如：4℃時緩沖液的pH＝8.4，則37℃時的pH＝7.4，所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0℃～4℃。③易吸收空氣中的CO2，所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封。④此緩沖液對某些pH電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。

⑶有機(jī)酸緩沖液

這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。

甲酸～甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發(fā)性強(qiáng)，使用后可以用減壓法除之。乙酸～乙酸鈉和檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多，檸檬酸有三個pKa值：pKa1＝3.10，pKa2＝4.75，pKa3＝6.40。琥珀酸有二個pKa值：pKa1＝4.18，pKa2＝5.60。

有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是：①所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對生化反應(yīng)過程可能發(fā)生干擾作用；②檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子（Fe3+、Zn++、Mg++等）結(jié)合而使緩沖液受到干擾；③這類緩沖液易與Ca++離子結(jié)合，所以樣品中有Ca++離子時，不能用這類緩沖液。

⑷硼酸鹽緩沖液

常用的有效pH范圍是：pH＝8.5～10.0，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點(diǎn)是配制方便，只使用一種試劑，缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物，尤其是能與糖類的羥基反應(yīng)生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。

⑸氨基酸緩沖液

此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有：

甘氨酸—HCl緩沖液：pH=2.0～5.0，

甘氨酸—NaOH緩沖液：pH=8.0～11.0，

甘氨酸—Tris緩沖液：pH=8.0～11.0，（此緩沖液用于廣泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液），

組氨酸緩沖液：pH=5.5～6.5，

甘氨酰胺（glycineamide）緩沖液：pH=7.8～8.8，

甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）緩沖液：pH=8.0～9.0。

此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是：為細(xì)胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。其缺點(diǎn)是：①與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，如代謝過程等。②試劑的價格較高。

⑹兩性離子緩沖液（Zwitterionicbuffers），又稱Good’s緩沖液1960年，N.E.Good和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩沖試劑的優(yōu)缺點(diǎn)后認(rèn)為，必須用人為設(shè)計和人工合成的方法來找到專門用于生命科學(xué)研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應(yīng)具有前面所述的九條要求和特性。他們合成的一系列Good’s緩沖液可查閱有關(guān)的資料。Good’s緩沖液的主要優(yōu)點(diǎn)是不參加和不干擾生物化學(xué)反應(yīng)過程，對酶化學(xué)反應(yīng)等無抑制作用，所以它們專門用于細(xì)胞器和極易變性的、對pH敏感的蛋白質(zhì)和酶的研究工作。其缺點(diǎn)是：①價格昂貴，②對測定蛋白質(zhì)含量的雙縮脲法和Lowry法不適用，因?yàn)樗鼈儠箍瞻坠艿念伾由?。PBS是最普遍不過的實(shí)驗(yàn)室緩沖液，但其配方各異。以下是我的總結(jié)：母液的配制：0.2MNa2HPO4：稱取71.6gNa2HPO4-12H2O，溶于1000ml水

0.2MNaH2PO4：稱取31.2gNaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水

各種濃度PB(pH=7.4)的配制：

先配0.2MPB(pH=7.4，100ml)：取19ml0.2mol/L的NaH2PO4，

81ml0.2mol/L的Na2HPO4,即可。

然后只需將0.2MPB(pH=7.4)按相應(yīng)比例適當(dāng)稀釋即可，如：

0.1MPB（PH=7.4）：取500ml0.2MPB，加水稀釋至1000ml即可。

0.01MPB（PH=7.4）：取50ml0.2MPB，加水稀釋至1000ml即可。

0.02MPB（PH=7.4）：取100ml0.2MPB，加水稀釋至1000ml即可。

若需要NaCL的話，加入NaCL至0.9%（g/100ml）即可。另另另：其它各種另PH值的0.2MPB（100ml)配方：

pH0.2MNaH2PO4（ml）0.2MNa2HPO4（ml）

5.7

93.5

6.5

5.8

92

8

5.9

90

10

6.0

87.7

12.3

6.1

85

15

6.2

81.5

18.5

6.3

77.5

22.5

6.4

73.5

26.5

6.5

68.5

31.5

6.6

62.5

37.5

6.7

56.5

43.5

6.8

51

49

6.9

45

55

7.0

38

62

7.1

33

67

7.2

28

72

7.3

23

77

7.4

19ml

81ml

7.5

16

84