樹2型糖尿病模型的建立

樹2型糖尿病模型的建立

糖尿病是一種主要以高血糖為特征的代謝性疾病。由于遺傳因素、環(huán)境因素和相互作用，它導(dǎo)致了相對缺乏胰島素活性和胰島功能異常引起的相對胰島素供應(yīng)不足。目前,全世界糖尿病患者~2.85億,未來20a的發(fā)病率將增長1倍(Shawetal,2010)。我國糖尿病患者已達(dá)9240萬,糖尿病前期患者1.48億,為全球糖尿病患者最多的國家(Yangetal,2010)。據(jù)中華醫(yī)學(xué)會糖尿病分會、國際糖尿病聯(lián)合會在2010年聯(lián)合國糖尿病日發(fā)布的一項糖尿病對社會經(jīng)濟影響的研究結(jié)果顯示,我國糖尿病導(dǎo)致的直接醫(yī)療開支占全國醫(yī)療總開支的13%,達(dá)1734億人民幣。顯然,2型糖尿病患病率的快速增長不僅嚴(yán)重危害我國以及全世界人民的生命健康,也給個人和國家?guī)砹司薮蟮慕?jīng)濟損失。糖尿病主要分為1型(胰島素依賴型)和2型(非胰島素依賴型)。一般認(rèn)為,1型糖尿病源于自身免疫系統(tǒng)紊亂,即胰島內(nèi)分泌胰島素的β細(xì)胞被體內(nèi)免疫系統(tǒng)攻擊而凋亡,導(dǎo)致胰島素缺乏。1型糖尿病發(fā)病較早(大多<16a),起病急且癥狀明顯,多見消瘦及酮癥,需依賴胰島素治療,且易出現(xiàn)酮癥酸中毒等急性并發(fā)癥。2型糖尿病則是一種典型的代謝紊亂,為糖尿病的最主要類型(占患者的90%),以出現(xiàn)胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能失常引起的相對胰島素不足為特征。2型糖尿病發(fā)病較晚(大多>40a),起病緩,多見超重和肥胖,無酮癥,不依賴于胰島素治療,但易出現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)并發(fā)癥,且病因復(fù)雜,涉及各種遺傳因素、環(huán)境因素以及兩者之間的相互作用等,具體的致病機理至今尚不清楚。通過建立動物模型來研究2型糖尿病的發(fā)病機制是預(yù)防和治療糖尿病的有效途徑。目前,鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)被廣泛地應(yīng)用于創(chuàng)建糖尿病動物模型。STZ是結(jié)構(gòu)類似于葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)的抗生素,通過GLUT2轉(zhuǎn)運到胰腺β細(xì)胞后,可使DNA斷裂引起β細(xì)胞凋亡,從而誘發(fā)高血糖。根據(jù)STZ注射劑量的大小以及注射次數(shù)的多少可以創(chuàng)建不同類型的糖尿病動物模型(Deedsetal,2011;Junodetal,1967;Kuttler&Schneider,1982;Rerup,1970)。在嚙齒類和非人靈長類動物中,可分別采用一次性大劑量和多次小劑量的注射方式創(chuàng)建類似1型和2型糖尿病的動物模型(Erdaletal,2011;Junodetal,1969;Kavanaghetal,2011;Koulmandaetal,2003;Nainetal,2012;Ventura-Sobrevillaetal,2011;Weietal,2011;Wuetal,2009)。但由于種屬差異性,嚙齒類動物(大、小鼠)糖尿病模型往往僅吻合人類糖尿病的部分病理過程和特征(Srinivasan&Ramarao,2007),而盡管非人靈長類動物糖尿病模型的血糖規(guī)律及病理特征均與人類糖尿病患者的臨床特征最為相似(Wagneretal,2006),但卻受限于倫理、資源稀缺、遺傳操作困難、成本高及周期長等,很難得到廣泛應(yīng)用。因此,需要去尋找一種適用于糖尿病研究的動物模型。樹鼩(Tupaiabelangerichinensis)隸屬于攀鼩目(Scandentia)樹鼩科(Tupaiinae),是靈長類動物的近親。Rabbetal(1966)在兩只菲律賓樹鼩(Urogaleeveretti)中觀察到自發(fā)糖尿病,這些樹鼩的表型,如酮癥、脫發(fā)及白內(nèi)障等均與人類糖尿病表型一致,且病理學(xué)檢查顯示其胰腺小島的β細(xì)胞缺失,被纖維細(xì)胞代替,與人類糖尿病發(fā)病機理一致。Ishikoetal(1997)和Xianetal(2000)初步報道了利用不同濃度的STZ誘導(dǎo)樹鼩糖尿病。然而,菲律賓樹鼩和樹鼩分屬兩個屬,物種間存在較大差異(Fuchs,1999)。STZ注射雖然可以誘導(dǎo)樹鼩糖尿病,但由于所用STZ劑量較高,導(dǎo)致糖尿病發(fā)病癥狀類似于1型糖尿病。因此,本文擬通過注射低劑量STZ來創(chuàng)建樹鼩2型糖尿病動物模型,以期為研究2型糖尿病發(fā)病機理提供新的動物模型。1材料和方法1.1動物籠舍與飼養(yǎng)24只健康成年雄性樹鼩,體重121~160g,均來自中國科學(xué)院昆明動物研究所動物實驗中心。動物單籠飼養(yǎng)于12h人工光照(光照時間08:00—20:00)的動物房中,室溫(25±3)℃,濕度40%~60%,自由飲食飲水,每天清理動物籠舍1次。實驗所用的樹鼩飼料來自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,含粗蛋白22.1%,粗脂肪6%,總熱量~4000kcal/kg(16747kJ/kg)。所有動物在實驗前適應(yīng)飼養(yǎng)>6周。本實驗方案獲得了中國科學(xué)院昆明動物研究所實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:SYBW20110101-1)。1.2儀器、試劑和儀器血糖檢測使用羅氏Accu-ChekPerformaBloodGlucoseMeter血糖測試儀;STZ購自Sigma公司(S0130);普通胰島素購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司;50%葡萄糖注射液購自昆明南疆制藥有限公司。1.3動物血糖檢測動物隨機分為4組,每組6只(表1)。A-con組:分別在第1天和第3天腹腔注射0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH4.2~4.5),注射時,將動物裝入不透光的布袋子中,待其安靜20min后給予注射和血糖監(jiān)測。A-60組:2~3次腹腔注射60mg/kg的STZ(STZ溶于0.1mol/L的檸檬酸緩沖液中,pH4.2~4.5,新鮮配制的STZ溶液需在15min內(nèi)用完),第一次注射后,每天監(jiān)測血糖值,如動物空腹血糖值≤7.0mmol/L,再補充注射,其中4只動物各注射3次(分別在第1天,第3天和第4天),另兩只動物各注射兩次(第1天和第3天)。A-70組:2~3次腹腔注射70mg/kg的STZ;第一次注射后,每天監(jiān)測血糖值,如動物空腹血糖值≤7.0mmol/L,再補充注射。其中4只動物注射各3次(第1天、第3天和第5天),另兩只動物各注射兩次(第1天和第3天)。A-80組:兩次腹腔注射80mg/kg的STZ,第一次注射后,每天監(jiān)測血糖值,如動物空腹血糖值≤7.0mmol/L,第4天補充注射1次。動物出現(xiàn)高血糖后,對于空腹血糖濃度>20.0mmol/L的動物每天給予普通胰島素注射1次,胰島素注射量從最初的1U/kg逐漸增加到8U/kg。由于A-60組中的成模動物在第9周時出現(xiàn)意外死亡和轉(zhuǎn)陰,實驗僅持續(xù)9周,另兩組實驗持續(xù)16周。1.4血糖、生化指標(biāo)所有動物在造模后每周測量空腹體重和空腹血糖各1次。測量前過夜禁食,所有動物分別裝入布袋中稱量體重,并從尾靜脈采血一滴,使用血糖儀測量血糖。另外,分別于造模前、后的每4周從股靜脈采血~1mL,檢測空腹?fàn)顟B(tài)下糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)及總膽固醇(TCHOL)等生化指標(biāo)。在第8周時采集動物尿液3~5mL,檢測尿糖、酮體、尿微量白蛋白和尿肌酐等。所有檢測均由云南省第一人民醫(yī)院雅培Ci16200全自動生化分析儀完成。1.5空腹體重和空腹血糖于成模后第4周和第10周進行口服葡萄糖耐量實驗。所有動物實驗前禁食12h,測量空腹體重和空腹血糖。根據(jù)每只動物的體重分別飼喂4mg/kg的葡萄糖,于飼喂后20、40、60、90、120及180min分別從尾靜脈采血一滴測定血糖。1.6血糖下降速度測定于成模后第5周進行胰島素耐量實驗。動物未禁食,測量體重及血糖。根據(jù)體重注射1U/kg的普通胰島素,測量注射后15、30、45、60及120min的血糖值,并以0min血糖值為基準(zhǔn),分別計算15、30、45、60及120min的血糖值與其的比值,用以衡量血糖下降速度。1.7數(shù)據(jù)分析利用Excel分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)以mean±SE表示,組間比較使用t-test,P<0.05為差異顯著。2結(jié)果2.1stz注射糖尿病模型各組樹鼩是否形成穩(wěn)定的糖尿病以連續(xù)4周空腹血糖值≥7.0mmol/L或糖化血紅蛋白(HbA1c)≥6.5%為標(biāo)準(zhǔn)(中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會,2011)。隨著STZ注射劑量的加大,動物成模率和死亡率都有所增加(表1)。注射STZ60、70及80mg/kg的動物成模率分別為66.7%、66.7%和100%,死亡率分別為16.7%、16.7%和33.3%。60mg/kgSTZ動物成模后,第4周的轉(zhuǎn)陰率高達(dá)50%,而70和80mg/kgSTZ動物的轉(zhuǎn)陰率為0(表1)。2.2平均體重的變化A-con組動物的平均體重和平均空腹血糖值維持在穩(wěn)定水平,未出現(xiàn)明顯變化(圖1)。其他3組動物在分別注射不同劑量(60、70和80mg/kg)STZ一周后,體重稍下降,但與注射前相比無顯著差異(P>0.05),且在隨后的15周內(nèi)體重恢復(fù)到注射前水平。其中,A-80組動物的平均體重還出現(xiàn)少許增長,雖在第16周有所下降,但與實驗前0周相比無顯著差異(P>0.05)(圖1A)。注射不同劑量STZ的3組動物的平均空腹血糖在注射一周后大幅上升,其中,A-60組動物在注射后第8周的平均空腹血糖值為(14.23±4.15)mmol/L,A-70和A-80組動物在注射后第16周的平均空腹血糖值分別為(15.10±5.33)和(16.54±4.95)mmol/L,與對照組相比均顯著升高(P<0.0001)(圖1B)。2.3各組大鼠的糖耐量第4周口服葡萄糖耐量試驗顯示,A-60、A-70和A-80動物在飼喂葡萄糖后的20、40、60及90min出現(xiàn)明顯的高血糖,遠(yuǎn)高于A-con組動物,且A-con組動物的口服葡萄糖耐量峰值出現(xiàn)在20min,而A-60、A-70和A-80組動物的波峰延遲,均出現(xiàn)在40min(圖2A)。另外,A-60、A-70及A-80組的糖耐量曲線下面積均顯著高于A-con組(依次分別為(74.43±12.18)、(76.93±13.67)、(77.77±14.38)和(46.57±3.09),P<0.05)(圖2B),各組糖耐量均顯著受損。第10周時,A-60組成模動物意外死亡,轉(zhuǎn)陰動物的口服葡萄糖耐量曲線仍顯示不正常,雖然其在20、40及60min的血糖值均低于A-con組動物的血糖值,但血糖持續(xù)上升到90min才出現(xiàn)峰值。A-70和A-80組動物在各個時間點的血糖值均顯著高于對照組和A-60組,而A-80組動物的峰值仍出現(xiàn)在40min。糖耐量曲線下面積也顯示A-70和A-80組顯著高于A-con和A-60組(依次分別為(130.4±24.32)、(130.55±4.76)、(67.33±6.65)和(61.58±1.81),P<0.05),糖耐量顯著受損。在胰島素耐量實驗中,A-60和A-70動物的血糖下降幅度雖高于對照組,但均不顯著(P>0.05),A-80動物的血糖下降幅度在30、60及90min顯著高于對照組(P<0.05)(圖3),表現(xiàn)一定程度的胰島素分泌不足。2.4血液生理生化指標(biāo)2.4.1不同注射前后動物中中總膽固醇的變化A-con組動物的糖化血紅蛋白、甘油三酯和總膽固醇水平均無顯著變化(表2)。A-60、A-70和A-80組的糖化血紅蛋白含量在STZ注射后第4周、第8周和第16周與注射前及A-con組相比均顯著升高(P<0.05),A-70和A-80組的該指標(biāo)增加2~3倍。A-60和A-70組甘油三酯的含量在STZ注射后第4周與注射前相比均顯著升高[分別為(0.87±0.33)mmol/L和(0.73±0.24)mmol/L,P<0.05],而在第8周、第12周和第16周則均無顯著變化(P<0.05)。A-70組甘油三酯的含量在第16周顯著下降[(0.35±0.14)mmol/L,P<0.05]。相比注射前的A-con組,A-80組甘油三酯的含量在第4周、第12周和第16周均略有升高,但變化不顯著,而在第8周時顯著升高[(0.85±0.35)mmol/L,P<0.05]。相比A-con組及注射前,A-60組動物的總膽固醇含量在STZ注射后第4周和第8周均無顯著變化。A-70組的總膽固醇含量僅在STZ注射后第4周相對A-con組顯著增高[(2.35±0.55)mmol/L,P<0.05],而在第8周、第12周和第16周均無顯著變化。A-80組的總膽固醇含量在STZ注射后,相對A-con和注射前均有所升高,但僅在第4周時具顯著水平[(2.19±0.12)mmol/L,P<0.05](表2)。2.4.2成模和對照組尿素氮含量的比較血尿素氮含量是反映腎功能的指標(biāo)之一。尿素氮含量在注射不同劑量的STZ后均大幅升高。A-60組尿素氮平均值在第4周和第8周時都較注射前升高~6mol/L,在第4周時顯著升高[(10.98±4.39)mmol/L,P<0.05]。A-70和A-80組動物在STZ注射后第16周,尿素氮含量較注射前顯著升高2~3倍(P<0.05)(表2)。另外,在我們分別取第8周時對照組和成模動物尿液,檢測其是否出現(xiàn)糖尿病腎病并發(fā)癥(表3)。尿糖含量在成模動物中均為“++++”,而A-con組動物沒有檢測到尿糖。在所有動物中均未檢測到酮體,表明樹鼩糖尿病并非1型糖尿病。成模組尿微量白蛋白含量為對照組的~3倍,而成模組和對照組的尿肌酐無顯著差異(P<0.05)。成模組尿微量白蛋白/尿肌酐比值為對照組的~5倍。2.4.3糖高滲檢測為檢驗動物在注射STZ后是否出現(xiàn)糖尿病乳酸中毒和高血糖高滲,我們檢測了乳酸、血鈉和血鉀含量(表2)。這3個指標(biāo)在對照組和STZ注射組均呈現(xiàn)相同的趨勢,即對照組及STZ組乳酸含量降低,各組血鈉值均升高,血鉀值均降低。3多次小劑量stz后大鼠的典型糖尿病進展本實驗發(fā)現(xiàn),多次小劑量STZ(60~80mg/kg)注射可誘導(dǎo)樹鼩出現(xiàn)明顯的糖尿病癥狀。成模動物均持續(xù)9~16周的高血糖,其糖化血紅蛋白顯著升高,且口服葡萄糖耐量明顯受損(表2,圖1,圖2)。該結(jié)果與前人使用一次性大劑量STZ(300mg/kg)(Ishikoetal,1997)和一次性注射80、100、120及150mg/kgSTZ(Xianetal,2000)的結(jié)果基本一致。但是,Xianetal(2000)注射80、100及120mg/kgSTZ不能建立長期穩(wěn)定的模型,不成模率和轉(zhuǎn)陰率較高,而150mg/kgSTZ則造成動物出現(xiàn)典型的“三多一少”癥狀。Ishikoetal(1997)使用300mg/kg的劑量則可以在2周內(nèi)誘導(dǎo)動物出現(xiàn)白內(nèi)障。這些研究結(jié)果表明樹鼩所出現(xiàn)的糖尿病癥狀更類似于1型糖尿病。Li(2010)曾分別在第1天、第7天和第28天注射120mg/kgSTZ,誘導(dǎo)樹鼩出現(xiàn)2型糖尿病癥狀。然而,我們前期的探索實驗中曾經(jīng)使用高劑量STZ(120mg/kg)注射樹鼩,在兩周內(nèi)由于血糖過高導(dǎo)致個體全部死亡。目前并不清楚是什么原因?qū)е虏煌芯咳藛T的實驗結(jié)果出現(xiàn)顯著差別。本研究使用多次小劑量STZ注射創(chuàng)建的樹鼩糖尿病發(fā)病癥狀更類似2型糖尿病。前人經(jīng)驗表明多次小劑量STZ注射可以部分破壞胰島β細(xì)胞,并引起巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤等炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致胰島素分泌不足(Kolb&Kr?ncke,1993)。因此,糖耐量試驗和胰島素耐量試驗結(jié)果分別顯示樹鼩注射STZ后出現(xiàn)糖耐受受損和胰島素相對分泌不足(圖2,圖3)。樹鼩注射STZ后,雖出現(xiàn)多飲、多食和多尿癥狀,但是,除A-80組動物在第16周時出現(xiàn)體重下降,動物在整個實驗過程中,體重均維持穩(wěn)定(圖1A)。該結(jié)果與STZ誘導(dǎo)CD1小鼠的結(jié)果一致(Ventura-Sobrevillaetal,2011)。另外,尿液中是否存在酮體也是區(qū)別1型和2型糖尿病的重要指標(biāo)(中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會,2011)。在本實驗中,STZ組樹鼩的尿液檢測分析均未出現(xiàn)酮體陽性,而且,其乳酸、血鈉及血鉀水平與同時期對照組相比亦未顯著升高,且成模動物未出現(xiàn)明顯的血糖高滲狀態(tài)和乳酸性中毒(表2)癥狀。這些結(jié)果均表明多次小劑量STZ誘導(dǎo)的樹鼩糖尿病癥狀與1型糖尿病不相似,而更類似于2型糖尿病。*:P<0.05vsbaseline;#:P<0.05vscontrolgroup;∞:A-70vsA-80,P<0.05.STZ注射后,A-70和A-80組動物的甘油三酯和總膽固醇含量均出現(xiàn)不同程度的升高,A-60組僅甘油三酯含量升高(表2)。臨床上,糖尿病患者多出現(xiàn)高甘油三酯血癥及膽固醇升高等脂代謝紊亂,從而增加患心腦血管疾病的危險(Shepherd,1994)。高血糖引起血液中甘油三酯和膽固醇含量升高的一個主要原因是由于脂蛋白酯酶——水解甘油三酯的酶調(diào)控水平發(fā)生變化(Goldberg,2001)。胰島素可以激活脂蛋白酯酶,若出現(xiàn)胰島素抵抗和胰島素分泌缺乏則會減少脂蛋白酯酶的激活,從而引起血液中甘油三酯含量升高,如果增加胰島素敏感性或給予外源胰島素注射,甘油三酯和膽固醇含量則會隨之下降(Goldberg,2001;Taskinen&Nikkila,1979)。胰島素耐量試驗顯示樹鼩注射STZ后胰島素相對分泌不足(圖3),提示這些樹鼩的脂代謝出現(xiàn)紊亂。雖然有必要進一步檢測各組動物脂蛋白酶活性的變化,但目前受檢測技術(shù)的阻礙,暫時不能檢測樹鼩脂蛋白酶活性。本實驗成模動物腎臟功能明顯受損(表2,表3)。尿素氮及微量白蛋白尿檢測是糖尿病腎病早期診斷的公認(rèn)指標(biāo)。本研究使用尿蛋白/肌酐比值來判斷樹鼩是否出現(xiàn)糖尿病腎病。我們發(fā)現(xiàn)成模動物的尿蛋白/肌酐比值顯著高于對照組動物,且各組動物的血尿素氮相對注射前均提高3~5倍。同時,腎臟病理切片也顯示部分成模動物出現(xiàn)輕微腎小球病變(結(jié)果未顯示)。這些結(jié)果都提示STZ誘導(dǎo)的樹鼩糖尿病模型表現(xiàn)明顯的腎功能受損。該現(xiàn)象也見于STZ誘導(dǎo)的非人靈長類和嚙齒類動物糖尿病模型(Krameretal,2009;Palmetal,2004)。由于STZ會對腎臟產(chǎn)生毒害(Weiss,1982),那么,糖尿病動物模型的腎臟損害應(yīng)歸因于STZ的毒性還是長期高血糖的作用。Palmetal(2004)指出STZ誘導(dǎo)的糖尿病動物模型出現(xiàn)的尿蛋白滲漏部分歸因于STZ的直接毒性,部分歸因于長期的高血糖狀態(tài),而Zafaretal(2009)分別對STZ誘導(dǎo)第2