耐鹽酵母的分離及特性研究

耐鹽酵母的分離及特性研究

柴油和魚露是由多種培養(yǎng)基制備的。有機酸、氨基酸和芳香性物質(zhì)的組成和含量常作為評價醬油質(zhì)量指標,其由醬醅質(zhì)量所決定。醬醅質(zhì)量是多種菌群相互作用的結(jié)果,以增香型耐高鹽酵母菌的參與尤為重要。因此,通過篩選得到優(yōu)質(zhì)的増香型耐高鹽酵母菌株并將其應(yīng)用于醬油的發(fā)酵中,對改善醬油的風味和質(zhì)量具有重要的意義。目前,為了得到耐鹽能力強的酵母菌,一般通過一定技術(shù)的誘變再篩選耐鹽酵母菌。顧金蘭等以釀酒酵母單倍體為出發(fā)菌株,通過紫外線和氯化鋰復合誘變,選育出耐鹽酵母突變株,其耐鹽度由10%提高到16%。趙紅梅等建立了從含糖量高的樣品中分離耐高滲酵母的簡單方法,分離得到1株極耐高滲釀酒酵母,該菌株能在60%的含糖培養(yǎng)基上生長。朱會霞等研究了經(jīng)過60Co誘變篩選得到了高產(chǎn)酒精耐鹽酵母Co-158菌株。因此,本文擬從自制高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油醬醪中分離純化出耐鹽酵母菌,并通過含有18%NaCl的固體培養(yǎng)基篩選出耐鹽性較好、活力旺盛且產(chǎn)醇能力強的菌株,經(jīng)形態(tài)學、生理生化和18SrDNA對其進行鑒定,為醬醪及魚露發(fā)酵提供新的菌種。1材料和方法1.1材料和試劑1.1.1試驗材料以自制高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油醬醪為分離耐鹽酵母的材料,其含3.0mol/L的NaCl。1.1.2培養(yǎng)基和試劑麥芽汁培養(yǎng)基,生化試劑,廣州環(huán)凱微生物有限公司;葡萄糖(分析純)、蛋白胨生化試劑,上海伯奧生物科技有限公司;酵母膏,生化試劑,國藥集團化學試劑有限公司。分離篩選培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基含3.0mol/LNaCl,瓊脂2%,121℃高壓滅菌15min);YEPD(即葡萄糖-酵母汁-蛋白胨培養(yǎng)基),用于細胞培養(yǎng),觀察細胞形態(tài);麥氏培養(yǎng)基,觀察子囊;碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基,氮源同化試驗;無鹽大豆培養(yǎng)基,分子鑒定用培養(yǎng)基;明膠培養(yǎng)基。1.2測試方法1.2.1菌種的分離、純化取醬醪10g,置于90mL無菌水中,充分振蕩。取1mL醬醪的稀釋樣品置于無菌培養(yǎng)皿中,再將熔化冷卻至45~50℃的分離培養(yǎng)基注入,待凝固后,于28℃倒置培養(yǎng)48~72h。挑取大的單菌落,多次劃線分離、純化,之后鏡檢,直至得到純化的菌種。挑取鏡檢確認為純化了的單菌落,于生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h,在生長培養(yǎng)基斜面保藏于4℃冰箱,同時制備甘油菌種保藏于-20℃。1.2.2發(fā)酵、培養(yǎng)液及發(fā)酵時間的觀察將菌種接種到葡萄糖-酵母汁-蛋白胨液體培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)3~7d,觀察是否發(fā)酵、培養(yǎng)液是否混濁,是否形成環(huán)或島,沉淀量多少及松緊狀況,并對單菌落中的菌體進行簡單染色用于鏡檢。將酵母在大豆汁瓊脂培養(yǎng)基上劃線,于28℃培養(yǎng)3~4d,觀察其菌落形態(tài)。1.2.3抗鹽細菌的生理生化特性1.2.3.接種及培養(yǎng)方將馬鈴薯培養(yǎng)基制成平板,菌株25℃活化后,在平板上劃線接種(每個平板2~3條),至少做2個平行,在菌線上蓋上無菌蓋玻片,在28℃下培養(yǎng)5~10d。1.2.3.糖質(zhì)糖的種類鑒定系統(tǒng)糖類包括:葡萄糖(GLU)、α-甲基-D-葡萄糖甙(MDG)、甘油(GLY)、N-乙酰-葡萄糖甙(NAG)、酮基-葡萄糖酸鹽(2-KG)、纖維二糖(CEL)、L-阿拉伯糖(ARA)、半乳糖(GAL)、乳糖(LAC)、D-木糖(XYL)、麥芽糖(MAL)、阿東醇(ADO)、已糖/蔗糖(SAC)、木糖醇(XLT)、海藻糖(TRE)、肌醇(INO)、松叁糖(MLZ)、山梨醇(SOR)、棉子糖(RAF)。1.2.3.360%葡萄糖生長每株酵母菌接3只含60%葡萄糖YEPD斜面在25℃條件下培養(yǎng),培養(yǎng)4周,每周觀察生長情況。1.2.3.有關(guān)35.0生長每株酵母菌接到0mol/LNaCl的YEPD斜面,在35℃條件下培養(yǎng),觀察生長情況。1.2.3.5.明膠溶液試驗菌種在大豆汁培養(yǎng)基活化后,接種到明膠培養(yǎng)中,培養(yǎng)3~5d。觀察前與4℃放置,觀察明膠有否液化,記錄結(jié)果。1.2.4抗鹽細菌的分子鑒定1.2.4.1.樣本預處理對液體酵母培養(yǎng)物,取適量培養(yǎng)物,8000r/min,4℃離心5min,并棄去上清液,在液氮或冰浴中研磨粉碎。1.2.4.2.提取母字取不多于50mg用液氮研磨后的菌體粉末,放入2.0mL微量離心管中。用酵母總DNA提取試劑盒提取。1.2.4.pcr反應(yīng)體系及條件18SrDNA鑒定:用于PCR擴增的引物為通用引物,正向引物EF3(5’-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3’);反向引物EF4(5’GGAAGGGR-TGTATTTATTAG-3’)。PCR反應(yīng)體系(50μL)為:10×Buffer5μL、10mmol/LdNTP2.0μL、10μmol/L引物各1.5μL、Taq酶0.5μL、模板2.0μL、ddH2O37.5μL,空白不加模板。PCR反應(yīng)條件為94℃預變性5min,94℃變性40s,退火溫度52℃,72℃延伸2.5min。30個循環(huán),72℃延伸10min(TP600PCRThermalCyclerDice,Takara,日本)。1.2.5yepd液體培養(yǎng)基菌種培養(yǎng):從醬油醪中分離并經(jīng)鑒定的酵母菌于YEPD斜面活化,再接種于YEPD液體培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)36h。接種于NaCl濃度分別為0、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0mol/L的YEPD斜面培養(yǎng)基中,每天觀察生長情況。1.2.6耐鹽母高鹽環(huán)境的生長2結(jié)果與分析2.1菌種的生長特性從表1可看出,由于4#菌株發(fā)酵后會產(chǎn)生不愉快的氣味,所以不能作為食品發(fā)酵使用菌種,被淘汰。1#、2#、3#菌種在含鹽量18%的培養(yǎng)基生長緩慢,所以該三株菌種耐鹽性低,被淘汰。5#和6#在含鹽量18%的平板上菌落生長快,菌落直徑較大,耐鹽性較強,且以此兩種菌株發(fā)酵形成的發(fā)酵產(chǎn)物,具有較濃醇香,因此,5#和6#具有潛在的應(yīng)用前景。因此對5#和6#兩株菌種進行鑒定。2.2抗鹽母的測定2.2.1細胞形態(tài)觀察如圖1所示,用美蘭染色后在普通光學顯微鏡下放大400倍觀察細胞形態(tài),5#和6#細胞形態(tài)為橢圓形或檸檬形、單生,有小芽著生于大細胞的一端,呈芽殖特征。上述特征與酵母菌相符。2.2.2子囊孢子的檢測將酵母用馬鈴薯培養(yǎng)基活化2~3代后麥氏斜面培養(yǎng)基上,于25℃培養(yǎng)3d~5d,即可形成子囊孢子。子囊孢子染色后鏡檢,可看到菌體中出現(xiàn)有藍色和紫紅色兩種顏色。其中藍色為菌體,紫紅色為子囊孢子。在相同放大倍數(shù)(100倍),5#菌比6#菌的菌體小。同樣培養(yǎng)時間,5#菌中子囊的密度要比6#多。2.2.3生理生化的評價2.2.3.1.發(fā)酵葡萄糖試驗酵母糖發(fā)酵試劑盒試驗結(jié)果見表2。2.2.3.菌種能力的測定兩株待鑒定菌落在60%葡萄糖的YEPD培養(yǎng)基中能夠生長;在35℃培養(yǎng)溫度下能夠形成菌落;明膠液化試驗中5#和6#菌均能液化明膠,具有分解蛋白質(zhì)的能力。通過查詢《酵母菌的特征及鑒定手冊》,5#和6#菌均與接合酵母菌屬和克魯克酵母屬的特征相符合。2.2.4系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建5#和6#菌染色體DNA用PCR擴增出單一條帶(結(jié)果略),PCR產(chǎn)物回收純化后經(jīng)DNA測序,序列長度為1701bp。將該序列應(yīng)用BLAST軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的細菌18SrDNA序列進行相似性比較,發(fā)現(xiàn):5#菌株18SrDNA的全長序列與Zygosaccharomycesrouxii(魯氏接合酵母)全長為1701核苷酸序列相比完全相同,同源性達到100%。以18SrRNA序列同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。18SrRNA序列的查詢ID為:5#SCAU,與NCBI數(shù)據(jù)庫中魯氏接合酵母的進化關(guān)系見圖3(A)。6#菌株的18SrDNA的全長序列與Zygosaccharomycesrouxii(魯氏接合酵母)全長為1701核苷酸序列相比沒有少核苷酸,只有7bp的差異,同源性達99%。6#菌株18SrDNA序列的查詢ID為:6#SCAU,比對序列見圖3(B)。目前建議的標準是將具有99~100%全序列相似性的判定為一個種,具有97%~99%全序列相似性的判定為一個屬。因此,可判定6#菌株是與魯氏接合酵母同一屬的酵母菌。2.3nacl濃度對菌株生長的影響從表3中可以看出,5#和6#酵母菌均能在NaCl濃度3.6mol/L以下生長,隨著NaCl濃度的增加兩株菌生長速度降低;當NaCl濃度達4.0mol/L時,兩株均無生長跡象。2.4不同nacl濃度對5#菌生長的影響由圖4可知,兩種酵母菌在沒有加NaCl的YEPD培養(yǎng)基中,生長平緩,5#菌的生長情況明顯優(yōu)越于6#菌;5#酵母菌在添加1.0mol/L和2.0mol/LNaCl的YEPD培養(yǎng)基生長量與無NaCl的相似,說明此濃度的NaCl對其生長沒有明顯影響,甚至添加NaCl還有利其生長;當NaCl濃度達3.0mol/L時,對5#菌的生長有明顯抑制作用,其生長量最低。從圖5可以看出,在添加NaCl的YEPD培養(yǎng)基,6#菌的生長量都高于無NaCl組;28℃培養(yǎng)36h后,添加0、1.0、2.0和3.0mol/LNaCl各組細胞干重分別為2.8g/L、9.1g/L、8.6g/L和9.2g/L,遠高于無NaCl培養(yǎng)基,說明添加一定量的鹽對其生長有利。通過對比可以得出,兩株酵母菌都具有較好的耐鹽性能,且6#菌的耐鹽性能比5#菌更優(yōu)。3菌株的篩選分離1.2.6.1YEPD培養(yǎng)基的NaCl終濃度分別為0、1.0、2.0、3.0mol/L;250mL三角瓶裝入19.5mL培養(yǎng)基,滅菌備用。每個處理3個重復。1.2.6.2種子制備及批次培養(yǎng):(1)活化菌株,把斜面菌種分別接入裝有6mLYEPD液體培養(yǎng)基的試管中,28℃培養(yǎng)36h,即為一級種子。(2)將一級種子接入裝有50mLYEPD液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,28℃培養(yǎng)36h,即為二級種子。(3)向裝有19.5mL含不同濃度的NaCl的YEPD培養(yǎng)基中接入二級種子0.5mL,于28℃培養(yǎng)。(4)每隔7