殺菌通透性增強(qiáng)蛋白對(duì)分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜的修復(fù)作用

殺菌通透性增強(qiáng)蛋白對(duì)分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜的修復(fù)作用

兩個(gè)主要因素是細(xì)菌感染和咽鼓管堵塞（eto）。細(xì)菌感染主要由革蘭氏陰性細(xì)菌引起,細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的有效成分,被認(rèn)為是產(chǎn)生OME的重要因素,而且研究結(jié)果已證實(shí)在中耳積液中有LPS的存在。殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(bactericidal/permeability-increasingprotein,BPI)是20世紀(jì)70年代末由Weiss等從中性粒細(xì)胞中提純出來(lái)的一種天然防御蛋白,水解后分裂成兩個(gè)部分:N-末端具有抗菌和結(jié)合、中和內(nèi)毒素的活性,C-末端具有調(diào)理吞噬及部分中和內(nèi)毒素功能。BPI與脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharidesbindingprotein,LBP)均能與LPS結(jié)合,但BPI與LPS的親和力比LBP與LPS的親和力高,LPS與BPI結(jié)合后就不能被LBP結(jié)合,由LPS引起的一系列炎癥反應(yīng)就被BPI抑制。BPI還具有調(diào)理功能,通過(guò)其氨基末端區(qū)與細(xì)菌表面的LPS結(jié)合,再通過(guò)其羧基末端區(qū)與吞噬細(xì)胞表面結(jié)合,形成橋狀連接,便于吞噬細(xì)胞吞噬這些細(xì)菌,尤其是有夾膜的、易逃避吞噬作用的細(xì)菌。近年有研究表明,BPI亦能對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌發(fā)揮作用,在感染肺炎球菌的Toll樣受體4(TLR4)缺乏的模型鼠中經(jīng)鼻給予重組BPI氨基端,能明顯提高生存率。在OME方面關(guān)于BPI的治療作用國(guó)內(nèi)外亦有相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用ETO和LPS注射方法制備OME大鼠動(dòng)物模型,觀察LPS和ETO導(dǎo)致中耳黏膜的變化,同時(shí)將BPI注射到OME動(dòng)物模型中,觀察BPI對(duì)損傷中耳黏膜的修復(fù)作用,探討B(tài)PI中和LPS、修復(fù)損傷的中耳黏膜的作用機(jī)制,為慢性O(shè)ME的治療提供一個(gè)新思路和新方法。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心純種Wistar大鼠20只(40耳),雌雄不限,體重200～250g,購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。光鏡(日本OLYMPUS),掃描電鏡(日本Philips),組織處理系統(tǒng)(德國(guó)LEICA公司),顯微鏡(日本OLYMPUS),倒置顯微鏡(德國(guó)Hurd公司)。1.2不同模型的耳鼓管阻塞試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前所有大鼠雙側(cè)中耳均經(jīng)顯微鏡檢查證實(shí)無(wú)中耳炎發(fā)生。20只大鼠隨機(jī)分為2個(gè)對(duì)照組和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組(1)即正常對(duì)照組,4耳;對(duì)照組(2)為BPI對(duì)照組,4耳,將50μL的2g·L-1BPI直接注射至中耳腔,使每只耳BPI的量大約為100μg。實(shí)驗(yàn)組(1)為ETO組,8耳,用1%戊巴比妥鈉(40mg·kg-1)麻醉后,在大鼠鼻咽部近鼻腔后端的兩側(cè),用80%三氯醋酸燒灼咽鼓管開(kāi)口處,造成大鼠咽鼓管阻塞;實(shí)驗(yàn)組(2)為L(zhǎng)PS注射組,8耳,通過(guò)鼓膜將2mg·L-1LPS溶液50μL注射到鼓室,使每只耳LPS的量大約為100ng;實(shí)驗(yàn)組(3)為ETO+LPS組,8耳,在ETO模型制備的同時(shí)通過(guò)鼓膜將2mg·L-1LPS溶液50μL注射到鼓室,使每只耳LPS的量大約為100ng,實(shí)驗(yàn)組(4)即ETO+LPS+BPI組,8耳,在ETO+LPS模型制備后2周將50μL的2g·L-1BPI直接注射至中耳腔,使每只耳BPI的量大約為100μg,這一用量為L(zhǎng)PS用量的1000倍,保證BPI能夠完全中和中耳腔的LPS。1.3組織切片的制備光鏡切片制備:在動(dòng)物模型制備后第1、2和4周時(shí)將動(dòng)物用1%戊巴比鈉麻醉后斷頭處死。分離出中耳聽(tīng)泡,剝離去除黏附組織,取出中耳黏膜,用10%的中性甲醛固定液固定24h。用10%乙二胺四乙酸鈉(EDTA)溶液脫鈣4～6d,蒸餾水洗后乙醇梯度脫水。二甲苯透明10min,浸蠟60min,沿黏膜斷面進(jìn)行包埋。將包埋組織進(jìn)行切片,切片厚度為6mm,將切片移入溫水盆,使切片漂浮在睡眠自然展平,再用已涂好防脫片膠的載玻片撈片。然后將載玻片置于70℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行烘干和溶蠟。切片采用HE染色。光鏡下對(duì)第4周咽鼓管鼓室口處的2個(gè)區(qū)域的纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。掃描電鏡切片制備:在顯微鏡下取出鼓室黏膜組織用生理鹽水清洗1次,放入0.2%胰蛋白酶溶液中室溫消化30min,PBS洗3次。2.5%戊二醛固定90min,用pH7.2～7.4的PBS洗3次,每次5min。再用1%鋨酸(OSO4)固定60min。蒸餾水洗1次,每次5～10min。梯度酒精脫水。用液體CO2臨界點(diǎn)干燥。離子濺射儀噴金,包金后用Philips掃描電鏡對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行分析。1.4統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理,咽鼓管鼓室口處的纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)以xˉ±s表示xˉ±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1兩組小鼠體內(nèi)造成的增張壓2.①正常對(duì)照組:大鼠的中耳黏膜保持正常形態(tài),咽鼓管的鼓室口處可見(jiàn)較多的假?gòu)?fù)層立方或柱狀上皮細(xì)胞,這些上皮細(xì)胞含有較多的纖毛細(xì)胞(26±4)和少量杯狀細(xì)胞(13±3),構(gòu)成大鼠中耳粘液纖毛輸送系統(tǒng)(圖1A,見(jiàn)封二)。②BPI對(duì)照組:大鼠中耳黏膜無(wú)明顯變化,纖毛細(xì)胞(25±3)和杯狀細(xì)胞(14±2)的數(shù)量也無(wú)明顯改變,與正常對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。③LPS注射組:中耳黏膜明顯增厚,在咽鼓管鼓室口可見(jiàn)纖毛細(xì)胞減少(9±3)及杯狀細(xì)胞增多(26±3),與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)。在增厚的上皮層內(nèi)可見(jiàn)血管擴(kuò)張、水腫,有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B,見(jiàn)封二)。④ETO組:咽鼓管鼓室口處中耳黏膜的變化與LPS注射組相似。在咽鼓管鼓室口可見(jiàn)纖毛細(xì)胞減少(12±2)和杯狀細(xì)胞增多(23±2),與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)。⑤ETO+LPS組:可見(jiàn)上皮層有明顯的腫脹和巨噬細(xì)胞的流入,由于血管擴(kuò)張、中性粒細(xì)胞的滲透及巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)導(dǎo)致中耳黏膜層明顯增厚。在咽鼓管鼓室口處假?gòu)?fù)層柱狀上皮也增厚,杯狀細(xì)胞數(shù)量有顯著增多(27±4),纖毛細(xì)胞減少(8±3),與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05),同時(shí)觀察到血管擴(kuò)張、腫脹、細(xì)胞滲透與LPS注射組及ETO組相似,然而細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)量比單獨(dú)LPS注射組、ETO組明顯增多(圖1C,見(jiàn)封二)。⑥ETO+LPS+BPI組:第4周杯狀細(xì)胞數(shù)(18±5)與ETO組、LPS注射組、ETO+LPS組比較明顯減少,差異有顯著性(P<0.05)。纖毛細(xì)胞(26±4)與ETO組、LPS注射組、ETO+LPS組比較顯著增加,差異有顯著性(P<0.05)(圖1D,見(jiàn)封二)。纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量與正常對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。2.2eto+lps組與注射組不同組織學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)指標(biāo)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間正常對(duì)照組和BPI對(duì)照組的黏膜保持正常形態(tài)(圖2A)。ETO組、LPS注射組及ETO+LPS組均顯示分泌細(xì)胞增多、纖毛細(xì)胞減少,且纖毛腫脹、擺動(dòng)方向紊亂,在ETO+LPS組可見(jiàn)到鵝卵石樣細(xì)胞構(gòu)成(圖2B和C)。在ETO+LPS+BPI組觀察到鼓室口的纖毛擺動(dòng)方向大致一致,無(wú)液體潴留,杯狀細(xì)胞較OME組明顯減少(圖2D)。2.3eto+lps檢測(cè)正常對(duì)照組及BPI對(duì)照組上鼓室黏膜均保持正常形態(tài),上鼓室處的黏膜由單層、扁平鱗狀上皮細(xì)胞和少量微絨毛構(gòu)成,纖毛細(xì)胞數(shù)量較咽鼓管鼓室口處明顯減少(圖3A,見(jiàn)封二)。LPS注射組與ETO組導(dǎo)致的上鼓室黏膜的改變相似,均觀察到數(shù)量較多的假?gòu)?fù)層立方纖毛細(xì)胞(圖3B～D,見(jiàn)封二)。ETO+LPS組可見(jiàn)到由咽鼓管鼓室口上皮層的明顯腫脹和巨噬細(xì)胞的流入及巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)導(dǎo)致的中耳黏膜層明顯增厚,且較咽鼓管鼓室口處的上皮更明顯,可見(jiàn)到細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)量比LPS注射組、ETO組明顯增多(圖3E,見(jiàn)封二)。在前1周主要觀察到中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),以后才觀察到巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。在ETO+LPS+BPI組可見(jiàn)到大致正常的中耳黏膜(圖3F,見(jiàn)封二)。2.4細(xì)胞正常形態(tài)和界限在正常對(duì)照組及BPI對(duì)照組可見(jiàn)上鼓室黏膜由扁平鱗狀上皮細(xì)胞和少量微絨毛組成,偶見(jiàn)纖毛細(xì)胞,扁平細(xì)胞均保持正常形態(tài),細(xì)胞界限清楚,呈多邊形(圖4A)。在LPS注射組、ETO組和LPS+ETO組,可見(jiàn)到上皮細(xì)胞有豐富的微絨毛,其表面不規(guī)則且腫脹,細(xì)胞界限較正常對(duì)照組欠清,并在ETO+LPS組見(jiàn)到較多的纖毛細(xì)胞(圖4B和C)。在ETO+LPS+BPI組見(jiàn)到大致正常的中耳黏膜。3討論3.1中耳黏膜組織學(xué)研究的意義本研究結(jié)果顯示,通過(guò)將LPS注射到大鼠中耳鼓室導(dǎo)致中耳黏膜明顯增厚。在咽鼓管鼓室口可見(jiàn)纖毛細(xì)胞減少、杯狀細(xì)胞增多,在上鼓室上皮層觀察到數(shù)量較多的假?gòu)?fù)層立方纖毛細(xì)胞。在增厚的上皮層內(nèi)可見(jiàn)血管擴(kuò)張、水腫,有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。上述結(jié)果證實(shí),LPS能使中耳黏膜產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng),直接導(dǎo)致中耳上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,造成黏液纖毛清除系統(tǒng)紊亂。ETO亦導(dǎo)致了與LPS注射組相似的中耳黏膜的變化,表明中耳黏膜上皮特別是在黏液纖毛輸送系統(tǒng)中起重要清除、引流作用的咽鼓管鼓室口是重要的防御系統(tǒng)。在ETO+LPS組中,也觀察到與ETO、LPS注射組相似的病理及形態(tài)學(xué)變化,但黏膜增厚程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)量、杯狀細(xì)胞增殖數(shù)量比ETO、LPS注射組嚴(yán)重。ETO+LPS可能導(dǎo)致較高濃度的LPS在中耳腔內(nèi)長(zhǎng)期殘留。因此LPS能導(dǎo)致持續(xù)的組織變化,推測(cè)由于LPS毒素作用和炎癥介質(zhì)的釋放,導(dǎo)致纖毛細(xì)胞變性的發(fā)生,繼而導(dǎo)致中耳黏液纖毛輸送系統(tǒng)紊亂。由于中耳黏膜炎癥變化,咽鼓管的炎癥改變引起ETO、中耳負(fù)壓;中耳黏膜的炎癥變化,造成中耳纖毛功能降低、分泌功能增強(qiáng),損傷了中耳黏液纖毛清除系統(tǒng),反過(guò)來(lái)中耳黏液纖毛輸送系統(tǒng)的紊亂又加重了咽鼓管阻塞,最終導(dǎo)致鼓室積液的形成。同時(shí)中耳腔潴留的積液、細(xì)菌和受損的黏膜上皮能促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放細(xì)胞因子,從而刺激中耳上皮轉(zhuǎn)化為以杯狀細(xì)胞為主的類(lèi)型,杯狀細(xì)胞的增殖是炎癥反應(yīng)或細(xì)菌感染的毒素反應(yīng)的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)研究表明,LPS和ETO通過(guò)中耳黏膜的炎癥反應(yīng),改變了黏液纖毛輸送系統(tǒng)中細(xì)胞的類(lèi)型、降低了纖毛細(xì)胞的活性,削弱黏液纖毛輸送系統(tǒng)的功能,導(dǎo)致OME的發(fā)生和反復(fù)遷延。中耳黏膜形態(tài)學(xué)的恢復(fù)是慢性O(shè)ME好轉(zhuǎn)的重要指標(biāo)。因此,本文作者認(rèn)為恢復(fù)中耳黏膜形態(tài)、提高纖毛細(xì)胞的活性、增強(qiáng)中耳黏液纖毛輸送系統(tǒng)的作用將有助于清除積液,利于中耳腔的通氣引流,阻止慢性O(shè)ME的發(fā)生。3.2bpi和lps的關(guān)聯(lián)目前臨床上對(duì)分泌性中耳炎的治療主要是抗生素,抗生素雖能殺滅細(xì)菌,但由于革蘭氏陰性菌死亡后釋放的LPS可長(zhǎng)期存留于中耳腔內(nèi),而且抗生素的抗菌作用可能通過(guò)細(xì)菌的損害而導(dǎo)致LPS釋放的增加,加重臨床癥狀,在這種情況下使用抗生素是無(wú)效的。BPI蛋白已經(jīng)被證實(shí)可以與廣泛系列的LPS相結(jié)合,中和LPS并抑制由LPS引起的一系列炎癥反應(yīng)的能力,對(duì)宿主抵抗GNB感染具有重要作用。Nell等首先對(duì)BPI在OME中的作用進(jìn)行了體內(nèi)研究,發(fā)現(xiàn)在OME模型制備后2周將BPI蛋白注射至中耳腔就能阻止大鼠中耳黏液纖毛輸送系統(tǒng)的紊亂。在本實(shí)驗(yàn)中也看到,ETO、LPS、ETO+LPS組都不同程度地導(dǎo)致了中耳黏膜病理及形態(tài)學(xué)的改變,然而將BPI直接注射至ETO+LPS組大鼠的中耳腔后,在光鏡下觀察到中耳黏膜上皮層中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,說(shuō)明BPI能抑制炎癥因子的聚集;掃描電鏡下可見(jiàn)OME的中耳黏膜經(jīng)BPI治療后杯狀細(xì)胞減少、纖毛細(xì)胞增加,證明BPI不僅糾正了由ETO、LPS導(dǎo)致的纖毛細(xì)胞與杯狀細(xì)胞分布比例、恢復(fù)了正常黏液纖毛輸送系統(tǒng)中細(xì)胞類(lèi)型,而且由于炎癥細(xì)胞的減少,黏膜層的厚度也降低,出現(xiàn)了正常的中耳黏膜形態(tài)。結(jié)果表明,BPI能有效地恢復(fù)中耳黏膜中ETO+LPS引發(fā)的中耳黏膜的變化,是一種能中和LPS和抑制GNB感染增殖的新型藥物。有研究測(cè)定大鼠OME模型中耳黏膜中的TNF-α、IL-6mRNA及蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示BPI治療組TNF-α、IL-6mRNA及蛋白的表達(dá)明顯低于LPS實(shí)驗(yàn)組,表明BPI有效地抑制了中耳黏膜IL-6mRNA及蛋白的表達(dá),說(shuō)明BPI能有效的中和中耳腔內(nèi)的LPS,減輕LPS對(duì)中耳黏膜的炎癥刺激和感染。綜上所述,BPI與LPS有特異的親和作用,能夠抑