甘草黃酮對2型糖尿病大鼠降糖降脂作用及相關(guān)機制研究

甘草黃酮對2型糖尿病大鼠降糖降脂作用及相關(guān)機制研究

甘草是甘草科的一種根和根莖。其主要功效是和中緩急、潤肺、解毒、調(diào)和諸藥等,是臨床應用最為廣泛的傳統(tǒng)中藥。甘草的主要成分為三萜皂苷類和黃酮類化合物。其中的黃酮成分(licoriceflavonoids,LF)在治療糖尿病[1~3]、抗腫瘤、治療心血管疾病以及抗病原微生物等方面均表現(xiàn)出良好的生物活性。我們前期對寧夏人工栽培甘草在化學成分、質(zhì)量分析方面進行了研究,并結(jié)合產(chǎn)業(yè)化要求,制訂了相關(guān)的質(zhì)量標準和(總)黃酮成分的提取工藝及質(zhì)量標準。本實驗采用高脂高糖飲食喂養(yǎng)后行低劑量鏈脲佐菌素(STZ)造模的大鼠2型糖尿病模型,對寧夏人工栽培甘草中黃酮成分的降血糖作用及其與抗氧化作用之間的關(guān)系進行了研究,以期為寧夏地區(qū)栽培甘草的開發(fā)利用提供藥理學研究依據(jù)。1材料和機器1.1動物1.2試劑與儀器甘草黃酮(LF)[4,5],棕黃色粉末,用時配成相應百分濃度(%)的混懸液,4℃冷藏備用。鏈脲佐菌素(STZ),Sigam生產(chǎn),批號1000712062,臨用時,將STZ溶解于0.1mol·L-1(pH4.4)檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液中,新鮮配制成3.0g·L-1STZ溶液。鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊(Met),北京圣永制藥有限公司生產(chǎn),批號100405。戊巴比妥鈉(barbitalsodium),Sigma分裝。測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)試劑盒,由北京北化康泰臨床試劑有限公司提供;測高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(FFA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和總抗氧能力(T-AOC)檢測試劑盒、糖化血紅蛋白(HbA1C)測定試劑盒,均為南京建成生物工程研究產(chǎn)品;放免法檢測胰島素含量測定試驗盒,由北京華英生物技術(shù)研究所提供。美國強生穩(wěn)豪血糖儀(Onetouchultra)及專業(yè)試紙;瑞麗VIS-7220N分光光度計(北京瑞麗分析儀器公司);尿十項分析儀及專業(yè)試紙(PU-4210,日本京都第一科學株式會社);放射免疫計數(shù)器(GC-1200γ,中國科大創(chuàng)新股份有限公司)。2方法2.12型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建2.1.1對大鼠的島素抵抗IR組大鼠,100只,行高糖高脂飼料養(yǎng)(10%豬油,10%蔗糖,5%蛋黃粉,75%普通飼料)喂養(yǎng),共喂養(yǎng)12周[6~10]。隨機挑選高脂飲食大鼠10只,正常飲食大鼠5只,進行胰島素抵抗大鼠的判定實驗。各組大鼠禁食不禁水12h(過夜)后行ip45mg/kg劑量巴比妥鈉麻醉,剪尾取血,測定血清TC、TG和FFA水平,并隨即進行糖耐量(oralglucosetolerancetest,OGTT)實驗及對應時間點的胰島素水平監(jiān)測,即ig2g/kg劑量葡萄糖后,測定5個時間點(0,10,30,60,120min)的血糖值和血清胰島素水平,并計算相應曲線下面積AUC,行高脂飼料組與對照組進行比較,以高脂血癥的形成、糖耐量及對應胰島素水平異常變化,判斷大鼠IR的形成[6~10]。本次實驗共獲得IR成模大鼠73只。2.1.2血糖及血糖檢測IR大鼠禁食不禁水12h,以35mg/kg的劑量一次性ip注射STZ,對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。1周后測定大鼠血糖水平,空腹血糖值≥16.7mmol/L的大鼠判斷為2型糖尿病成模大鼠。血糖不達標,行重復ig35mg/kg劑量STZ。本次實驗共獲得2型糖尿病成模大鼠42只。2.2給藥劑量及給藥時間供試SD大鼠42只,分為正常對照組(10只),ig相應量的生理鹽水;模型對照組(6只),ig相應量的生理鹽水;LF高劑量組(9只),行300mg/kg劑量ig給藥;LF低劑量組(10只),行100mg/kg劑量ig給藥;Met陽性藥物對照組(7只),行300mg/kg劑量ig給藥。藥物干預共進行40d。每天上午給藥。期間測定空腹血糖值3次,即給藥前,其后第20,40天分別測定1次,并同時進行體質(zhì)量檢測。期間常規(guī)飼料喂養(yǎng)。2.3指標檢測2.3.1液體中的生化指標的測定組織標本取材前1d,采用尿十項分析儀及專業(yè)試紙,按操作手冊測定尿糖值,24h尿蛋白值、酮體值。2.3.2血糖檢測方法組采用投資試驗及測定總血糖藥物干預實驗結(jié)束后,各組大鼠禁食不禁水過夜(12h);行ip45mg/kg劑量巴比妥鈉麻醉;開胸,心尖取血,采用強生穩(wěn)豪血糖儀及試紙測定空腹血糖值;按照試劑盒程序要求進行血漿HbA1C的測定。2.3.3抗逆效應的測定2.4組均數(shù)和差別的比較所有數(shù)據(jù)均采用表示,采用單因素方差分析One-wayANOVA進行各組均數(shù)與對照組的比較,并采用DunnettMultipleComparisonsTest判斷差別,P<0.05判斷差別具有顯著性。結(jié)果采用GraphPadInStat3.06軟件實施分析。3結(jié)果3.1胰島素抵抗大鼠的實驗結(jié)果3.1.1大鼠血糖指標比較行12周高脂飲食喂養(yǎng),大鼠的空腹血糖和糖耐量值與常規(guī)飲食喂養(yǎng)組比較,沒有差別。結(jié)果見表1~2。結(jié)果與文獻一致,高脂飲食不會引起血糖指標異常。而OGTT實驗中,可見10min和30min時間點大鼠血液中胰島素水平較常規(guī)飲食喂養(yǎng)組升高明顯(P<0.05,P<0.01,見表1),且AUC比較,存在差別(P<0.05,見表2),說明實驗中高脂飲食會引起糖負荷后胰島素分泌異常。結(jié)果表明大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗表現(xiàn),為后續(xù)給予小劑量STZ建立大鼠2型糖尿病模型奠定了條件。3.1.2骨折、發(fā)育階段大鼠經(jīng)過12周高脂飲食喂養(yǎng),TG、TC和FFA水平明顯升高,高脂血癥形成。見表2。結(jié)合血糖和胰島素水平的變化,進一步說明實驗中實施高脂高糖飲食喂養(yǎng)后大鼠成功出現(xiàn)胰島素抵抗,對隨后2型糖尿病模型的建立提供了保障。3.2lf的量效和時效效應從表3可以得出,模型組在研究期限內(nèi),體重的減輕及變動(SD值偏大)較為明顯。經(jīng)過藥物的干預,其中300mg/kg劑量的LF組體質(zhì)量減輕的趨勢得到改善,同樣的情況也出現(xiàn)在Met組,而100mg/kg劑量的LF雖不能對抗體重減輕的趨勢,但可以改善實驗過程中體質(zhì)量的波動(SD減小)。總之,就體質(zhì)量的改善,LF的作用呈一定的量效關(guān)系和時效關(guān)系。藥物干預前實驗大鼠的初始血糖值明顯高于對照組(見表3)。結(jié)果表明,35mg/kg劑量的STZ給予,造模成功。藥物干預過程中進行的3次空腹血糖檢測結(jié)果表明,與模型組相比較,LF具有降低基礎(chǔ)血糖的作用,并呈現(xiàn)量效和時效關(guān)系。說明LE具有降低2型糖尿病大鼠基礎(chǔ)血糖的作用。3.3lf及met干預效果2型糖尿病模型組HbA1C和尿糖值明顯高于正常對照組,符合2型糖尿病指征。見表4。結(jié)合空腹血糖值和體質(zhì)量的變化特點(見表3),進一步說明2型糖尿病模型建立成功。LF及Met干預后,HbA1C指標和尿糖值均有顯著的改善(P<0.05,P<0.01,見表4),LE的作用呈現(xiàn)量效關(guān)系。說明LE具有改善實驗大鼠2型糖尿病的作用。另外,儀器同時檢測了尿中尿蛋白含量值和酮體含量值,由于沒有差別,故而數(shù)值未列出。與對照組比較,﹟﹟P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;△儀器的最大量程3.4糖尿病患者lf及met干預的必要性檢驗模型組血漿TG、TC、LDL和FFA較對照組均有不同的增加,HDL有不同的降低,結(jié)果符合糖尿病特征,表明模型建立成功(見表5)。LF及Met干預后,血脂指標均有不同程度的改善,其中HDL的升高最為明顯(P<0.01,見表5)。結(jié)果表明,LF能夠改善II型糖尿病的脂質(zhì)水平,減輕脂質(zhì)損傷,并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。3.5lf及met干預前后抗氧化酶系統(tǒng)的比較模型組血清SOD、GSH-Px水平降低,氧化應激終產(chǎn)物MDA水平較對照組明顯升高(見表6)LF及Met干預后,抗氧化酶系統(tǒng)均有不同程度的改善,并伴有MDA水平的降低。結(jié)果表明,LF能夠改善2型糖尿病變現(xiàn)出的氧化應激損傷,并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。與對照組比較,﹟P﹤0.05;與對照組比較,﹟﹟P﹤0.01;與模型組比較,*P﹤0.05;與模型組比較,**P﹤0.014以甘草為原料的道地藥材研究本實驗采用高脂高糖飲食喂養(yǎng)后行低劑量STZ造模的大鼠2型糖尿病模型,對寧夏地區(qū)栽培甘草中獲得的LF的降糖、降脂作用,及與抗氧化作用之間的關(guān)系進行了研究。結(jié)果表明,LF具有降低2型糖尿病實驗大鼠基礎(chǔ)血糖、降低尿糖值、降低血中HbA1C水平的作用同時,改善血脂,升高血清SOD、GSH-Px水平,降低MDA水平的作用。甘草已成功作為寧夏地區(qū)道地藥材,實現(xiàn)廣泛栽培種植。我們前期對寧夏栽培甘草在化學成分、質(zhì)量分析方面進行了研究。并結(jié)合產(chǎn)業(yè)化要求,制訂了相關(guān)的質(zhì)量標準和(總)黃酮成分的提取工藝標準。既往的研究表明從甘草中獲得的甘草黃酮具有降血糖、及調(diào)節(jié)糖尿病相關(guān)分子靶點生物活性的作用。而對于2型糖尿病動物模型的降糖、降脂作用及相關(guān)機制研究,尚未見報道。甘草黃酮的抗氧化、抗自由基作用的研究,由來已久。2型糖尿病的發(fā)生與氧化應激機制的關(guān)系密切,所以,甘草黃酮的抗氧化、抗自由基作用被認為是防治糖尿病及其并發(fā)癥的主要機制[1~3]。我們的