杉木愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

杉木愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

f.木材是世界著名的熱帶樹(shù)種。它生長(zhǎng)迅速，材料齊全。廣泛應(yīng)用于造船、橋梁、建筑、高級(jí)家具和雕塑等領(lǐng)域。木蘭也是中國(guó)亞熱帶和南亞熱帶最重要的造林和經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。種植在9個(gè)省、60多個(gè)市（市），總面積約2萬(wàn)公頃。中國(guó)沒(méi)有樹(shù)木的自然分布，物種資源極度不足。種植的普及受到土壤ph、低溫凍害、銹病和野生水稻等問(wèn)題的嚴(yán)重影響。采用傳統(tǒng)育種方法開(kāi)發(fā)秋葵移植技術(shù)，培育抗寒性、抗蟲(chóng)、抗病性和速生轉(zhuǎn)換劑對(duì)加快我國(guó)秋葵的普及栽培具有重要意義。從葉盤(pán)、莖段、胚軸、子葉等外植體上誘導(dǎo)并轉(zhuǎn)化愈傷組織,然后再生出轉(zhuǎn)基因植株是植物轉(zhuǎn)基因的重要方法之一.本文中優(yōu)化了柚木莖段愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件,為柚木轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究、轉(zhuǎn)基因育種研究和功能基因?qū)W研究奠定了基礎(chǔ).1試驗(yàn)材料和方法1.1愈傷組織誘導(dǎo)葉片外植體誘導(dǎo)取具有4～5對(duì)葉片、高度為6～8cm的無(wú)菌試管苗,切取長(zhǎng)度為1.2～1.5cm、不帶腋芽的莖段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),以愈傷組織連同莖段一起作外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因參數(shù)的優(yōu)化.農(nóng)桿菌則采用含有雙元載體pAL4404和pBI121的常用菌株LBA4404.1.2測(cè)試方法1.2.1農(nóng)桿菌的培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+BA0.5mg/L,光照強(qiáng)度為2500lx,光照時(shí)間為10h,培養(yǎng)溫度為26～28℃.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)參照《植物基因工程》的方法.愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的條件與愈傷組織相同.1.2.2植物ph試驗(yàn)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)設(shè)置7、9、11、13、15、17d6種處理;共培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)設(shè)置7、9、11、13d4種處理;共培養(yǎng)pH試驗(yàn)設(shè)置6.2、6.0、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0這7種處理;菌液光密度(OD值)試驗(yàn)設(shè)置0.3～0.4、0.4～0.5、0.5～0.6、0.6～0.7、0.7～0.8、0.8～0.9這6種處理,因菌液光密度難以控制,部分處理的光密度與試驗(yàn)設(shè)計(jì)略有偏差.采用7813、7557、108和7531這4個(gè)無(wú)性系進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化敏感性的無(wú)性系差異測(cè)定.1.2.3做好個(gè)案研究所有試驗(yàn)的每個(gè)處理重復(fù)8瓶,每瓶6個(gè)莖段,共48個(gè)重復(fù).由于實(shí)際操作中存在一定的污染率,每個(gè)處理比預(yù)定的重復(fù)瓶數(shù)增加2～3瓶,以確保每個(gè)處理到調(diào)查時(shí)有足夠的瓶數(shù).如果沒(méi)有污染,多余的瓶數(shù)則隨機(jī)去除.1.2.4染色gus參照《植物分子實(shí)驗(yàn)指南》的方法,共培養(yǎng)結(jié)束后即進(jìn)行GUS染色.1.2.5死亡鑒定在實(shí)體顯微鏡下放大40倍觀察愈傷組織的GUS染色結(jié)果,調(diào)查指標(biāo)有愈傷組織藍(lán)斑數(shù)、莖段表皮藍(lán)斑數(shù)、愈傷組織顏色、愈傷組織質(zhì)量、愈傷組織死亡率和莖段外植體死亡率.正常的柚木愈傷組織為白色、淡綠色或淡黃色,愈傷組織變成黑褐色和水浸狀時(shí)視為死亡.正常莖段的表皮顏色為綠色或淡綠色,莖段變成深黃色或褐色時(shí)視為死亡.2結(jié)果與分析2.1預(yù)培養(yǎng)7d/莖段藍(lán)斑的增加預(yù)培養(yǎng)使得外植體的細(xì)胞處于旺盛的細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)狀態(tài),從而容易被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化.表1顯示,愈傷組織藍(lán)斑數(shù)從預(yù)培養(yǎng)7d的12.76個(gè)/莖段逐漸增加至11d的25.64個(gè)/莖段,13d和15d的藍(lán)斑數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定,而超過(guò)17d,藍(lán)斑數(shù)量呈下降趨勢(shì);愈傷組織的有斑率則變動(dòng)不大,均在60.0%～65.9%范圍內(nèi).因此,LBA4404轉(zhuǎn)化柚木愈傷組織時(shí)預(yù)培養(yǎng)11～15d為佳.2.2d時(shí)愈傷組織藍(lán)斑數(shù)由表2可知,7557愈傷組織與LBA4404共培養(yǎng)的時(shí)間少于9d時(shí),愈傷組織藍(lán)斑數(shù)小于1.3個(gè)/莖段;當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到13d時(shí),愈傷組織藍(lán)斑數(shù)量最高,為16.06個(gè)/莖段.因此共培養(yǎng)天數(shù)以13d為好,莖段愈傷組織藍(lán)斑數(shù)量最多,愈傷組織有藍(lán)斑率也最高.2.3不同ph值對(duì)轉(zhuǎn)化減作劑轉(zhuǎn)化效率的影響由表3可知,LBA4404對(duì)108無(wú)性系愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率隨pH值的降低而呈現(xiàn)下降趨勢(shì),當(dāng)pH值低于5.4時(shí),轉(zhuǎn)化效率顯著下降.莖段愈傷組織藍(lán)斑數(shù)的方差分析結(jié)果顯示,pH值在5.6至6.2之間差異不顯著,但顯著高于pH為5.0至5.4.因此,適宜于LBA4404轉(zhuǎn)化柚木愈傷組織的共培養(yǎng)pH為5.6～6.2.但是,適宜于LBA4404轉(zhuǎn)化莖段表皮細(xì)胞的pH則為5.2～5.8,與適宜于轉(zhuǎn)化愈傷組織的pH值范圍有所不同.2.4菌液濃度及數(shù)量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率最高,但對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的菌液濃度比較小,農(nóng)桿菌個(gè)體數(shù)量不足.光密度是菌液濃度的最好指標(biāo),當(dāng)菌液光密度OD600小于0.3時(shí),農(nóng)桿菌個(gè)體數(shù)量不足;光密度超過(guò)1.0后,培養(yǎng)基的養(yǎng)分和氧氣供應(yīng)不足,農(nóng)桿菌菌液中死亡個(gè)體的比例增加,多數(shù)情況下不適宜于轉(zhuǎn)化.LBA4404轉(zhuǎn)化8301愈傷組織的結(jié)果表明,光密度在0.498至0.805的范圍內(nèi)均有較高的轉(zhuǎn)化效率(見(jiàn)表4).2.5個(gè)愈傷組織的轉(zhuǎn)化不同基因型或無(wú)性系對(duì)農(nóng)桿菌的侵染具有不同的敏感性.LBA4404對(duì)7813、108和7531這3個(gè)無(wú)性系的愈傷組織均具有較高的轉(zhuǎn)化效率,而對(duì)其莖段表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化頻率則比較低;7557則相反,愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率低,而莖段表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率高,藍(lán)斑數(shù)量顯著高于其它3個(gè)無(wú)性系.因此,對(duì)柚木無(wú)性系進(jìn)行篩選,選擇容易被農(nóng)桿菌侵染的無(wú)性系開(kāi)展轉(zhuǎn)基因研究.2.6農(nóng)桿菌工程菌液的制備及驗(yàn)證農(nóng)桿菌工程菌液中含有50mg/L的卡那霉素.若直接用于接種,植物細(xì)胞受卡那霉素的影響而失去部分活力,感受態(tài)細(xì)胞數(shù)量減少,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低.對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明,用重新懸浮、不含卡那霉素的農(nóng)桿菌液進(jìn)行轉(zhuǎn)化,愈傷組織和莖段表皮的藍(lán)斑數(shù)量與未重新懸浮的對(duì)照相比顯著提高(見(jiàn)表6).說(shuō)明卡那霉素對(duì)柚木愈傷組織和表皮細(xì)胞的影響大,農(nóng)桿菌工程菌液宜用柚木液體培養(yǎng)基重新懸浮后再用于接種.在共培養(yǎng)基中附加100μmol/L的乙酰丁香酮(AS)后,莖段愈傷組織的平均藍(lán)斑數(shù)略有降低,說(shuō)明乙酰丁香酮對(duì)柚木愈傷組織的轉(zhuǎn)化沒(méi)有促進(jìn)作用(見(jiàn)表7).可能原因是柚木為雙子葉植物,本身可以分泌足夠數(shù)量的信號(hào)物質(zhì),誘導(dǎo)農(nóng)桿菌附著愈傷組織并活化Vir區(qū)基因.3共培養(yǎng)ph值對(duì)農(nóng)桿菌vir基因表達(dá)的影響共培養(yǎng)時(shí)間是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的重要技術(shù)參數(shù)之一.因細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異、釋放的受傷信號(hào)強(qiáng)弱不同、忍受農(nóng)桿菌危害的能力不同,不同植物最適宜的共培養(yǎng)時(shí)間差異較大.水稻、棉花、馬鈴薯等多數(shù)農(nóng)作物的最適共培養(yǎng)時(shí)間為2～6d,桉樹(shù)、木麻黃、楊樹(shù)、白樺等多數(shù)林木為3～6d.柚木愈傷組織與LBA4404的適宜共培養(yǎng)時(shí)間為13d,比常見(jiàn)植物種類(lèi)的2～6d長(zhǎng)了許多.共培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,導(dǎo)致植物組織的死亡和轉(zhuǎn)化效率的降低.但柚木莖段與LBA4404共培養(yǎng)5d后莖段外植體和愈傷組織未受明顯影響,共培養(yǎng)15d時(shí),愈傷組織死亡率僅為6.3%.可見(jiàn),LBA4404侵染柚木時(shí)對(duì)愈傷組織和莖段的致死作用比較小.除轉(zhuǎn)化愈傷組織外,LBA4404還轉(zhuǎn)化柚木莖段的表皮細(xì)胞,平均每個(gè)莖段的表皮藍(lán)斑數(shù)在3.69至21.67個(gè)之間.不過(guò),隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),莖段表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率呈明顯下降趨勢(shì).可能是由于莖段的內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)逐漸用于形成愈傷組織,活力逐漸下降的緣故.試驗(yàn)觀察還發(fā)現(xiàn),隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和愈傷組織的萌發(fā)與增大,莖段表皮由綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色,最終變成淺黃色.pH值對(duì)農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的活化和表達(dá)有顯著的影響,當(dāng)培養(yǎng)基的pH值低于6.0時(shí),比較適宜于農(nóng)桿菌Vir基因的誘導(dǎo)表達(dá).柚木是一種不耐酸性的樹(shù)種,土壤的pH值為6.5左右時(shí)最適宜于生長(zhǎng).柚木外植體的愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基pH值也比較高,為6.0～6.4.因此,選擇合適的共培養(yǎng)pH值,既滿足農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因活化的要求,又適宜于愈傷組織的生長(zhǎng)成了轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化的關(guān)鍵之一.本研究結(jié)果顯示,柚木愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率隨pH值的減小而降低,pH值小于5.6時(shí)轉(zhuǎn)化效率顯著下降,因?yàn)閜H值越低越不適合愈傷組織的生長(zhǎng).柚木愈傷組織適宜的共培養(yǎng)pH值為5.6～6.2,比其它植物種類(lèi)要求的6.0以下略高.共培養(yǎng)pH為5.6～6.2的適宜范圍既滿足了柚木愈傷組織生長(zhǎng)的要求,又兼顧了農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因活化的要求.受傷植物組織分泌的