高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與鹽脅迫適應(yīng)性機(jī)制

高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與鹽脅迫適應(yīng)性機(jī)制

土壤鹽嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量，降低了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力。鹽漬生境中,過多的Na+破壞植物體內(nèi)離子平衡、引起生物膜失活、新陳代謝活性下降,最終導(dǎo)致植物生長受到抑制甚至死亡。Na+是土壤溶液中的大量元素,濃度范圍在0.4~150mmol·L-1,濃度較低時,可以促進(jìn)某些植物的生長,是有益元素,但濃度較高時,大多數(shù)植物的生長受到嚴(yán)重抑制。K+是植物所必需的大量元素之一,與Na+有相似的水合半徑。鹽脅迫時,非選擇性陽離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不能將二者區(qū)分,大量Na+的吸收抑制了植物根系對K+的攝入,植物體內(nèi)K+/Na+降低,造成鹽害,因此維持細(xì)胞質(zhì)中高的K+/Na+是植物應(yīng)對脅迫的有效措施。高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HKT(High-affinityK+Transporter)能維持植物體內(nèi)離子平衡,增強(qiáng)植物耐鹽性。本研究就HKT蛋白的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期闡述其與植物耐鹽性的關(guān)系。1hkt基因家族Schachtman和Schroeder首次從小麥(Triticumaestivum)中克隆了HKT蛋白基因TaHKT2;1,其開放閱讀框(ORF)編碼534個氨基酸,分子量58.9KD,具有10~12個跨膜區(qū),位于第7號染色體上,原位雜交顯示TaHKT2;1主要在根皮層和葉維管組織細(xì)胞中表達(dá)。繼小麥TaHKT2;1之后,先后在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、桉樹(Eucalyptuscamaldulensis)、水稻(Oryzasativa)、冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)等植物中發(fā)現(xiàn)了HKT基因,與大腸桿菌(Escherichiacoli)TrkH、超嗜熱菌(Aquifexaeolicus)KtrB、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)Trk1,2等共同構(gòu)成一個超級K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族。根據(jù)異源表達(dá)系統(tǒng)上的離子選擇性特征差異和氨基酸序列同源性分析,Platten等將HKT蛋白分為兩類:第1類以擬南芥AtHKT1;1為代表,包括鹽地堿蓬SsHKT1;1、水稻OsHKT1;5和冰葉日中花McHKT1;1等,通常為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,有的也能轉(zhuǎn)運(yùn)K+;第2類以小麥TaHKT2;1為代表,包括水稻OsHKT2;1、大麥(Hordeumvulgare)HvHKT2;1等,為K+-Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,雙子葉植物缺少此類蛋白基因(圖1)。HKT基因通常含有兩個內(nèi)含子,且第1類上的內(nèi)含子明顯比第2類大,而一粒小麥(Triticummonococcum)TmHKT1;4-A2只有一個內(nèi)含子。這種命名法可以分析不同物種相同基因和相同物種不同基因在進(jìn)化和功能上的區(qū)別與聯(lián)系。高等植物HKT蛋白的氨基酸數(shù)目多在500個左右。有的HKT蛋白基因是單拷貝,或是一個小基因家族,通常受鹽脅迫和K+饑餓誘導(dǎo),可以在根、莖、葉和花等不同組織中表達(dá)(表1)。拒鹽型鹽生植物小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)PutHKT2;1在鹽脅迫時,根中表達(dá)量增加,地上部變化不大,而鹽地堿蓬SsHKT1;1葉中表達(dá)量高于根中。不同物種基因組中HKT基因數(shù)目差異很大,擬南芥只有1個AtHKT1;1,而Garciadeblás等在水稻品種日本晴(Nipponbare)基因組中發(fā)現(xiàn)7個可能編碼Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的HKT基因(另2個為假基因)。2g-g-g-g-g蛋白Durell等認(rèn)為原核生物含有1個MPM(Membrane-Pore-Membrane),包括2個跨膜螺旋和1個P環(huán),植物HKT蛋白由KcsA類K+通道亞基經(jīng)復(fù)制加倍及融合進(jìn)化而來,所以包含4個MPM,此模型已在小麥、水稻和擬南芥中得到證實(shí)(圖2)。HKT蛋白4個MPM高度保守,并且含有1個甘氨酸-酪氨酸-甘氨酸(GYG)基序,研究表明,HKT蛋白存在與K+和Na+選擇性吸收相關(guān)的多個位點(diǎn),且多位于P環(huán)或離P環(huán)很近的區(qū)域。第1類HKT蛋白第1個P環(huán)過濾器位置處有1個絲氨酸殘基,其余3個P環(huán)上為甘氨酸殘基,構(gòu)成S-G-G-G類型;第2類HKT蛋白第1個P環(huán)處的絲氨酸殘基被甘氨酸代替,其余3個P環(huán)處仍為甘氨酸殘基,構(gòu)成G-G-G-G類型,水稻OsHKT2;1例外(圖3)。注:圖中箭頭所指的為P環(huán)中保守的甘氨酸或絲氨酸殘基。Note:ArrowsinthefigurereferstoGorSsite.Rubio等認(rèn)為小麥TaHKT2;1中存在1個高親和性K+結(jié)合位點(diǎn)和1個高親和性Na+結(jié)合位點(diǎn),Km分別為3和175μmol·L-1。為確定這些位點(diǎn),Diatloff等采用定點(diǎn)突變和酵母(Saccharomycescerevisiae)突變體(K+吸收缺陷)異源表達(dá)方法,發(fā)現(xiàn)小麥TaHKT2;1一段16個氨基酸保守序列在Na+轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮著重要作用。Rubio等發(fā)現(xiàn)小麥TaHKT2;1突變體N365S通過緩解對高親和性K+吸收的抑制、減少低親和性Na+吸收,從而降低酵母體內(nèi)Na+/K+,顯著提高鹽敏感型酵母(Na+ATPase缺失)的耐鹽性。Liu等對小麥TaHKT2;1蛋白上可能參與K+、Na+選擇性吸收相關(guān)位點(diǎn)做了進(jìn)一步研究,認(rèn)為跨膜區(qū)3和4之間的高電荷P環(huán)上可能存在這些位點(diǎn),環(huán)中片段L149-E180缺失后轉(zhuǎn)入酵母中,提高了酵母體內(nèi)K+/Na+,增強(qiáng)了其耐鹽性。M?ser等認(rèn)為植物HKT蛋白存在4個P環(huán),若第1個P環(huán)中過濾器處為甘氨酸殘基,通常為K+-Na+的共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;若第1個P環(huán)中過濾器處為絲氨酸殘基,通常為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。擬南芥AtHKT1;1與小麥TaHKT2;1嵌合體試驗(yàn)表明,在擬南芥AtHKT1;1中將Ser-68突變?yōu)楦拾彼岷蟀l(fā)現(xiàn),增大了K+的通透性;在小麥TaHKT2;1中將Gly-91突變?yōu)榻z氨酸,K+通透性受到抑制。但第2類HKT蛋白的甘氨酸殘基并不是決定K+選擇性吸收的唯一因素,因?yàn)橐恍┑?類HKT蛋白同樣具有K+轉(zhuǎn)運(yùn)特性,且賴氨酸和精氨酸殘基對于K+吸收可能也有作用。3抗鹽食品3.1小麥回復(fù)突變基因的結(jié)構(gòu)及功能Epstein等認(rèn)為高等植物中存在兩個K+吸收系統(tǒng):1)當(dāng)K+濃度較低時,主要由K+載體起作用的高親和性吸收系統(tǒng);2)當(dāng)K+濃度較高時,主要由K+通道起作用的低親和性吸收系統(tǒng)。小麥TaHKT2;1的發(fā)現(xiàn)為此假說提供了直接證據(jù)。Schachtman和Schroeder采用功能互補(bǔ)法,從小麥幼根cDNA文庫中篩選到能互補(bǔ)酵母K+吸收缺陷的TaHKT2;1,其編碼蛋白對幾種單價陽離子的選擇性順序?yàn)镵+>Cs+>Rb+>Na+>NH4+。Gassmann等證明TaHKT2;1屬于K+-Na+同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。當(dāng)Na+濃度較低時,介導(dǎo)兩種離子吸收;當(dāng)Na+濃度較高、K+濃度較低時,介導(dǎo)低親和性Na+吸收,K+吸收受到抑制。因此小麥TaHKT2;1的轉(zhuǎn)運(yùn)特性與外界離子情況密切相關(guān)。Laurie等將反義的TaHKT2;1轉(zhuǎn)入小麥后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源TaHKT2;1強(qiáng)烈下調(diào),在100mmol·L-1NaCl濃度下,轉(zhuǎn)基因植株22Na+內(nèi)流明顯低于對照組;在200mmol·L-1NaCl濃度下,轉(zhuǎn)基因株系根部的Na+濃度更低,轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性提高,由此認(rèn)為小麥TaHKT2;1在整株水平上的生理功能是介導(dǎo)Na+吸收。小麥含有A、B和D三個基因組,硬粒小麥(T.turgidum)含有A和B兩個基因組,前者比后者具有更高的耐鹽性,因此推測小麥基因組D中可能含有耐鹽性位點(diǎn)。Dubcovsky等從小麥4D染色體中分離到的Kna1能控制K+和Na+向地上部選擇性運(yùn)輸,維持體內(nèi)高的K+/Na+,提高其耐鹽性。Munns等從硬粒小麥耐鹽品系149中分離到兩個與Na+外排相關(guān)的位點(diǎn),Nax1和Nax2。James等研究表明,Nax1能夠從根木質(zhì)部和葉鞘中卸載Na+,防止Na+在葉片中過度積累,Nax2僅在根部發(fā)揮作用。Huang等采用圖位克隆法從一粒小麥(T.monococcum)中分離到兩個可能的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TmHKT1;4-A1(TmHKT7-A1)和TmHKT1;4-A2(TmHKT7-A2),TmHKT1;4-A2主要在根部和葉鞘中表達(dá),參與Na+在根部和葉鞘木質(zhì)部中的卸載,被認(rèn)為是Nax1的候選基因。Byrt等發(fā)現(xiàn)TmHKT1;5-A是Nax2的候選基因。3.2突變體ss3-1和atskr1的表達(dá)Uozumi等從擬南芥(A.thaliana)中克隆到AtHKT1;1,在非洲爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopuslaevisoocytes)中表達(dá)分析表明,AtHKT1;1為專一的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,外界K+濃度不影響其轉(zhuǎn)運(yùn)特性;擬南芥AtHKT1;1在酵母突變體G19(Na+-extrudingATPase基因缺失)中表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)G19對鹽更敏感,但小麥TaHKT2;1在G19中表達(dá)后降低了其鹽敏感性;AtHKT1;1不能互補(bǔ)酵母突變體CY162(缺失Trk1和Trk2)的K+吸收缺陷,但能使大腸桿菌(Escherichiacoli)突變體(無K+吸收功能,KAT1被點(diǎn)突變)LB2003在低K+培養(yǎng)基上生長。Rus等研究發(fā)現(xiàn),AtHKT1;1的突變(athkt1-1,athkt1-2)能抑制擬南芥sos3-1(saltoverlysensitive)的鹽敏感性,HKT1;1的缺失提高了sos3-1的耐鹽性,而且改善了sos3-1的缺K+表型,雙突變體sos3-1hkt1-1幼苗的耐鹽性提高,由此認(rèn)為,AtHKT1;1介導(dǎo)根部Na+吸收。但Berthomieu等認(rèn)為AtHKT1;1不參與根部Na+吸收,因?yàn)橥蛔凅wsas2-1(AtHKT1;1功能缺失)的Na+內(nèi)流比野生型還高20%。Munns提出假設(shè),地上部過多的Na+隨韌皮部汁液流轉(zhuǎn)運(yùn)至根中,限制過多Na+在地上部積累對于提高植物耐鹽性非常重要。Berthomieu等研究發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫下,突變體sas2-1韌皮部汁液中Na+的含量顯著降低,Na+在葉中大量積累,但根中Na+含量降低,定位研究表明,AtHKT1;1主要在各器官的韌皮部組織中表達(dá),由此認(rèn)為AtHKT1;1參與Na+從地上部到根部的長距離運(yùn)輸,將地上部過多的Na+裝載到韌皮部汁液中,防止過多Na+在地上部富集。生理學(xué)研究表明,無機(jī)離子(如K+和Na+)被裝載到根木質(zhì)部中,在蒸騰拉力作用下向上運(yùn)輸,之后被轉(zhuǎn)移到葉木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中,接著離子在薄壁細(xì)胞中卸載,經(jīng)共質(zhì)體途徑進(jìn)入韌皮部,重新返回根中。Sunarpi等采用GUS染色和免疫定位技術(shù)證明,AtHKT1;1主要在木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中表達(dá),在韌皮部組織中僅有少量表達(dá),因而提出AtHKT1;1從根木質(zhì)部汁液中卸載Na+到周圍薄壁細(xì)胞中,防止過多Na+上運(yùn)至地上部。Davenport等采用22Na同位素示蹤法進(jìn)行驗(yàn)證表明,AtHKT1;1主要介導(dǎo)Na+從木質(zhì)部中的卸載。M?ller等將AtHKT1;1在擬南芥根中柱區(qū)域超表達(dá)后發(fā)現(xiàn),與對照相比,轉(zhuǎn)基因植株地上部Na+含量下降37%~64%,因?yàn)锳tHKT1;1將更多的Na+卸載到木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中,提高了擬南芥的耐鹽性。AtHKT1;1對木質(zhì)部K+沒有直接調(diào)控作用。一種假設(shè)認(rèn)為,AtHKT1;1將Na+卸載到木質(zhì)部周圍薄壁細(xì)胞中,隨著Na+不斷積累,引起薄壁細(xì)胞質(zhì)膜去極化,激活外整流K+通道蛋白(KOR)或非選擇性離子外整流通道蛋白(NOR)活性,K+被裝載到木質(zhì)部向地上部運(yùn)輸。Gaymard等從擬南芥中分離到K+外整流通道蛋白基因AtSKOR,異源表達(dá)系統(tǒng)結(jié)果和突變體atskor試驗(yàn)顯示,AtSKOR介導(dǎo)K+從木質(zhì)部薄壁細(xì)胞向木質(zhì)部的裝載。Zhang等研究表明,枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)GB03能調(diào)節(jié)AtHKT1;1在組織中的特異性表達(dá),提高擬南芥的耐鹽性,在100mmol·L-1鹽脅迫下,GB03上調(diào)AtHKT1;1在地上部的表達(dá)量,而根中表達(dá)量降低。認(rèn)為AtHKT1;1在鹽脅迫時根中表達(dá)量下調(diào),可以減少Na+進(jìn)入根中,地上部表達(dá)量增加,可以使更多的Na+裝載到韌皮部中,隨韌皮部汁液運(yùn)輸?shù)礁?降低Na+在地上部的積累,從而提高了耐鹽性。綜上所述,當(dāng)AtHKT1;1基因被敲除后,突變體植株會隨著Na+含量的不斷升高出現(xiàn)生長緩慢,地上部嚴(yán)重萎黃[29,44,50,55,56,57],說明AtHKT1;1在維持?jǐn)M南芥體內(nèi)K+和Na+穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。3.3對耐鹽蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Horie等在水稻中克隆到OsHKT2;1,在爪蟾卵母細(xì)胞和酵母中表達(dá)分析表明,OsHKT2;1對Na+有強(qiáng)選擇性,但也介導(dǎo)K+的轉(zhuǎn)運(yùn),不能互補(bǔ)低K+條件下酵母突變體的K+吸收功能缺陷。Horie等研究發(fā)現(xiàn),在缺鉀和低鹽條件下,突變體oshkt2;1與野生型相比,oshkt2;1大大降低了根部Na+內(nèi)流。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),OsHKT2;1主要在根部皮層和內(nèi)皮層表達(dá),因此認(rèn)為OsHKT2;1可以介導(dǎo)根部有益Na+吸收,部分行使K+功能,減緩缺K+對植株的傷害。Horie等在耐鹽品種Pokkali中分離到OsHKT2;2,其與小麥和大麥HKT2;1親緣關(guān)系相近,為Na+-K+共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,能互補(bǔ)低K+條件下酵母突變體的K+吸收功能缺陷,表達(dá)模式與OsHKT2;1相似,其表達(dá)受K+饑餓誘導(dǎo)。Kader等研究表明,在150mmol·L-1鹽處理下,OsHKT2;2轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),且在葉韌皮部中表達(dá)。但Garciadeblás等認(rèn)為,在水稻品種日本晴和Pokkali中,OsHKT2;2都是假基因。Ren等從水稻中分離出與耐鹽相關(guān)的遺傳位點(diǎn)SKC1(ShootK+Content),候選基因?yàn)镺sHKT1;5。在爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)分析表明,OsHKT1;5為Na+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要在木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中表達(dá)。在鹽處理?xiàng)l件下,根中表達(dá)量顯著高于地上部,且隨著脅迫時間的延長,根中OsHKT1;5表達(dá)量上調(diào),而地上部變化不大。OsHKT1;5可以將過多的Na+從木質(zhì)部中卸載到周圍薄壁細(xì)胞中,降低木質(zhì)部汁液中Na+含量,防止向地上部轉(zhuǎn)運(yùn),間接使得K+向地上部運(yùn)輸,從而提高地上部的K+/Na+,在Na+長距離運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用。3.4鹽地堿蓬體內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)控Fairbairn等從桉樹中分離到EcHKT1;1和EcHKT1;2,它們編碼的蛋白都能互補(bǔ)大腸桿菌突變體TK2463在缺K+條件下的K+吸收功能缺陷,在爪蟾卵母細(xì)胞中介導(dǎo)K+和Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)。由于HKT蛋白對TEA+和Cs+不敏感,但對Ba2+非常敏感,Wang等研究發(fā)現(xiàn),在25mmol·L-1NaCl處理下,Ba2+顯著降低海濱堿蓬(S.maritima)根部Na+凈吸收和22Na+內(nèi)流,而TEA+和Cs+對其沒有影響,因此推測HKT蛋白可能介導(dǎo)海濱堿蓬在低鹽濃度下低親和性Na+吸收。Shao等從鹽地堿蓬中克隆到SsHKT1;1,其表達(dá)受K+饑餓和鹽脅迫誘導(dǎo),主要在葉中表達(dá),根中表達(dá)量相對較少,可能參與鹽地堿蓬體內(nèi)離子穩(wěn)