cd3、cd4、cd8對細(xì)胞增殖能力的影響

cd3、cd4、cd8對細(xì)胞增殖能力的影響

許多研究證明了這兩種情況下男女的免疫反應(yīng)不同。根據(jù)該報(bào)告，雄性激素受體存在于胸腺和骨髓的不成熟免疫細(xì)胞，但成熟的免疫細(xì)胞沒有出現(xiàn)。此外，雌激素和雌激素受體也存在于胸腺細(xì)胞中，并能誘導(dǎo)胸腺的萎縮。這些結(jié)果提示類固醇激素很可能促成了免疫系統(tǒng)的雌、雄差異,然而確切的機(jī)制尚不清楚。本研究的目的是通過比較年幼的雌、雄小鼠的免疫應(yīng)答,分析免疫應(yīng)答的差異與性激素分泌前后的關(guān)系。我們用3～9周齡(含青春期前、中、后)的BALB/C小鼠,分離胸腺和外周淋巴細(xì)胞,經(jīng)CFSE標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測體外不同刺激劑后T細(xì)胞CD3、CD4、CD8表面標(biāo)志的不同表達(dá)。結(jié)果表明免疫系統(tǒng)的性別二態(tài)現(xiàn)象可能位于青春期前。1材料和方法1.1雜交瘤細(xì)胞接種小鼠腹瀉制備雌、雄性BALB/C小鼠,3～9周,購自中科院遺傳所?？筎CRαβmAb(H57.597)為雜交瘤細(xì)胞接種小鼠腹腔制備的腹水。FITC標(biāo)記的抗CD8mAb(536.7)、PE標(biāo)記的抗CD4mAb(GK1.5)、PerCP標(biāo)記的抗TCR方法mAb(H57.597)均購自PharMingen公司(晶美公司代理)。1.2方法1.2.1dmso-cfse法標(biāo)記細(xì)胞5-Carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,簡稱CFSE(MolecularProbes,Eugenem,OR)溶于DMSO,濃度為5mmol/L,-20℃存放,作為母液。PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107ml-1,加入CFSE,終濃度為5μmol/L,37℃孵育10分鐘,孵育結(jié)束后,迅速用冷10%NCS1640溶液洗滌細(xì)胞3次。1.2.2細(xì)胞引導(dǎo)因子10%NCS-1640溶液調(diào)整胸腺、外周淋巴細(xì)胞濃度為1×106ml-1,加入24孔板,分別加入anti-TCRαβmAb(50μg/ml包被,37℃,2小時(shí))、刀豆蛋白A(ConA2.5μg/ml,Pharmacia)、佛波醇酯(PMA)和鈣離子載體(ionomycin,IONO)(PMA濃度10ng/ml,IONO濃度300ng/ml)共刺激,細(xì)胞在含5%CO2孵箱培養(yǎng)3天。1.2.3facs細(xì)胞的檢測1×106細(xì)胞加入1μg熒光抗體,4℃,40分鐘,2%NCS-BSS洗去游離抗體。染色后的細(xì)胞加入FACS保存液,用CELLQuest軟件在裝配雙激光管的流式細(xì)胞儀(FACSCalibur,BD公司)上進(jìn)行分析。多重染色時(shí),用同種性熒光染色的對照,調(diào)節(jié)流式細(xì)胞儀的電壓。1.2.4統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)分析。2小鼠的免疫特性2.1斷頸處死3～9周年齡段的小鼠,稱取體重后,用無菌方法取出胸腺和脾臟,稱重。每年齡段小鼠3只,取三次獨(dú)立試驗(yàn)的均值。結(jié)果不同年齡段雄性小鼠體重均超過雌性,4～5周時(shí)雄性小鼠的體重增加迅速,由4周時(shí)約(11.2±5.3)mg增至(18.4±6.2)mg,6～9周體重增加不明顯(P>0.05),由約(20.5±10.1)mg增至(23.1±11.3)mg。雌性小鼠體重是逐漸增加的,每周大約增加(2.3±1.6)mg。比較相同時(shí)間段雌雄小鼠胸腺和脾臟大小,結(jié)果6周雄性小鼠胸腺(80±10)mg明顯大于雌性小鼠(44±15)mg,6周后胸腺的重量減少,雄性小鼠比雌性明顯(P<0.05)。器官與體重百分比卻無明顯差異。脾臟和胸腺的細(xì)胞數(shù)量與器官重量的改變相一致。2.2分離脾臟、胸腺淋巴細(xì)胞,CFSE標(biāo)記后,細(xì)胞分別用抗TCR抗體、ConA、PMA+Ionomycin進(jìn)行刺激,3天后,各種刺激劑作用下細(xì)胞表面CFSE的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)梯度衰變趨勢,FACS分析比較不同刺激劑對不同年齡段T淋巴細(xì)胞的活化作用,結(jié)果PMA+Ionomycin作用最強(qiáng)。在PMA+Ionomycin刺激劑作用下,3～7周小鼠脾細(xì)胞存在明顯的性別差異,7～8周小鼠脾細(xì)胞對抗TCR抗體誘導(dǎo)的增殖應(yīng)答也存在性別差異:雌性小鼠增殖能力明顯低于雄性小鼠(圖1A)。胸腺細(xì)胞對PMA+Ionomycin的增殖應(yīng)答無明顯的性別差異。胸腺細(xì)胞對ConA,抗TCR抗體刺激劑的應(yīng)答能力低于脾細(xì)胞(圖1B)。2.3小鼠按性別、年齡分組:3～4周組,6～9周組,每年齡段小鼠3只,取三次獨(dú)立試驗(yàn)的均值。分別用三染分析脾臟T淋巴細(xì)胞表面CD3、CD4、CD8的表達(dá)(圖2A),結(jié)果6～9周小鼠CD3+細(xì)胞所占百分率明顯高于3～4周小鼠,年長小鼠CD4、CD8的表達(dá)量也高于年幼小鼠。脾細(xì)胞CD3、CD4、CD8的表達(dá)量與性別無關(guān)。胸腺細(xì)胞CD3、CD4、CD8免疫表型分析顯示(圖2B),6～9周小鼠胸腺CD4、CD8單陽性細(xì)胞含量多于3～4周小鼠,而CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞含量少于3～4周小鼠。胸腺CD3表達(dá)無年齡改變。胸腺細(xì)胞CD3、CD4、CD8的百分率無性別差異。3抗tcr抗體、論哲學(xué)的作用本次研究我們觀察到脾臟和胸腺大小與年齡有關(guān),證實(shí)了以前的研究:胸腺隨著年齡的增加而減小。本次結(jié)果顯示6～8周齡雄性小鼠脾臟和胸腺重量的減少比雌性小鼠明顯,并且雄性小鼠的胸腺變化更明顯,這種變化與青春期開始后雄激素分泌有關(guān)。稱取處死后3～7周齡雄性小鼠的睪丸,發(fā)現(xiàn)隨著胸腺重量的減小,睪丸重量增加(數(shù)據(jù)沒顯示),支持了雄激素能誘導(dǎo)胸腺萎縮的觀點(diǎn)。雌性小鼠胸腺重量的減少與雄性小鼠相比不明顯,我們的數(shù)據(jù)也支持了雌激素誘導(dǎo)胸腺萎縮比雄激素慢的觀點(diǎn)。雄激素和雌激素對胸腺產(chǎn)生不同的影響,但我們的實(shí)驗(yàn)顯示:青春期前后胸腺的免疫表型和胸腺細(xì)胞的增殖并沒有雌雄差異。3～4周小鼠不成熟的CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞雖多于6～9周小鼠,但對于絲裂原刺激的應(yīng)答卻沒有不同。抗TCR抗體的作用類似抗原識別的生理過程,ConA也是通過細(xì)胞表面TCR進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo),并使細(xì)胞凝聚,介導(dǎo)細(xì)胞—細(xì)胞間輔助分子與配體的結(jié)合,并能提供一些輔助刺激信號;因此經(jīng)TCR進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗TCR抗體、ConA刺激劑,僅對成熟T細(xì)胞起活化識別作用,胸腺內(nèi)成熟T細(xì)胞僅占10%,抗TCR抗體、ConA刺激劑的促增殖作用較小。PMA+ionomycin是一種強(qiáng)的絲裂原,可不經(jīng)TCR的識別,直接激活PKC和胞內(nèi)的鈣離子庫,而直接活化胞內(nèi)雙信號,無論不成熟的髓質(zhì)細(xì)胞還是成熟的髓質(zhì)區(qū)細(xì)胞均可對PMA+ionomycin產(chǎn)生應(yīng)答。抗TCRαβ抗體刺激劑誘導(dǎo)7～8周小鼠脾細(xì)胞的增殖應(yīng)答有性別差異,并且6～9周脾細(xì)胞CD3+細(xì)胞數(shù)量明顯多于3～4周的幼鼠,但CD3+脾細(xì)胞的總數(shù)和成熟CD4、CD8T細(xì)胞的百分率無性別差異,為此,雄性小鼠細(xì)胞的高增殖應(yīng)答可能反應(yīng)了對經(jīng)TCR進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗TCR抗體刺激劑的高敏