考點49基因工程的工具及操作程序（講義）（原卷版）

考點49基因工程的工具及操作程序基因工程的基本工具限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱）——分子手術(shù)刀存在：主要存在于中。作用：識別DNA分子的特定，并且使每一條鏈中特定部位的斷開。特點：具有。結(jié)果：形成或。原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵。限制酶作為一種防御工具，可切割外源DNA，使之失效，進行保證原核生物的安全。原核生物中不存在相應(yīng)限制酶的識別序列或識別序列已被修飾，故限制酶不切割自身的DNA。DNA連接酶——分子縫合針（1）作用：連接兩個DNA片段。（2）主要種類：①：從大腸桿菌中分離得到，只能連接具有互補的DNA片段。②：從T4噬菌體中分離出來，可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的和雙鏈DNA片段的。T4DNA連接酶雖然兩種末端均能連接，但連接平末端的效率相對較低。（3）DNA連接酶和限制酶的區(qū)別與聯(lián)系項目類型限制酶DNA連接酶作用使特定部位的磷酸二酯鍵在DNA片段之間重新磷酸二酯鍵應(yīng)用用于目的基因和載體用于目的基因片段與載體的聯(lián)系基因進入受體細胞的載體——分子運輸車（1）質(zhì)粒：一種、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞或原核細胞之外，并具有能力的雙鏈DNA分子。（2）其他載體：和等。（3）載體必需的條件（以質(zhì)粒為例）①有一個至多個切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中。②能在受體細胞中進行，或整合到上，隨受體DNA同步復(fù)制。③有特殊的，便于重組DNA分子的篩選。易錯提醒：工具包括3種：限制酶（限制性內(nèi)切核酸酶）、DNA連接酶、載體；工具酶包括2種：限制酶（限制性內(nèi)切核酸酶）、DNA連接酶。真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蚰康幕虻暮Y選與獲?。?）篩選合適的目的基因①目的基因：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因。主要指的基因，如Bt抗蟲蛋白基因。②篩選方法：和清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。如培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中用到的蘇云金桿菌的Bt抗蟲蛋白基因。b.通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因。（2）利用PCR獲取和擴增目的基因①PCR：即聚合酶鏈式反應(yīng)，是一項根據(jù)的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)。②條件緩沖溶液維持溶液的pHDNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板2種引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料耐高溫的DNA聚合酶——TaqDNA聚合酶。③步驟過程說明圖解變性當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條DNA單鏈結(jié)合延伸72℃左右時，在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，可使DNA新鏈有5’端向3’端延伸每次循環(huán)一般可以分為三步。目的基因的數(shù)量：目的基因的數(shù)量呈指數(shù)形式增長，擴增循環(huán)n次，DNA的數(shù)量約為2n。儀器：PCR擴增儀PCR產(chǎn)物鑒定：常用瓊脂糖凝膠電泳?；虮磉_載體的構(gòu)建（1）目的：使目的基因在受體細胞中存在，并且給下一代，同時使其能夠和作用。（2）基因表達載體的組成：啟動子、目的基因、終止子、復(fù)制原點以及標記基因等。組成功能啟動子一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。終止子一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的下游，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來。標記基因一般是抗生素抗性基因，還有發(fā)光基因、產(chǎn)生特定顏色的表達產(chǎn)物的基因等，用來篩選、鑒別受體細胞是否含有目的基因。（3）基因表達載體的構(gòu)建模式圖將目的基因?qū)胧荏w細胞（1）導(dǎo)入植物細胞常用的方法①法②法a.轉(zhuǎn)化：進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持和的過程。b.農(nóng)桿菌的特點：農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的上。c.原理：將目的基因插入的中，通過的轉(zhuǎn)化作用，使目的基因進入細胞。（2）導(dǎo)入動物細胞的方法①受體細胞：②常用方法：③程序?qū)⒑心康幕虻谋磉_載體提純→取卵→獲得受精卵→顯微注射→早期胚胎培養(yǎng)→胚胎移植→發(fā)育成具有新性狀的動物（3）導(dǎo)入原核細胞的方法①方法：②程序【微點撥】【微點撥】Ca2+處理細胞，使細胞膜的通透性發(fā)生改變。目的基因的檢測與鑒定（1）分子水平的檢測①檢測目的基因是否插入或是轉(zhuǎn)錄出mRNA：等技術(shù)。②檢測目的基因是否翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)：提取受體中的蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進行。（2）個體生物學水平的鑒定對目標性狀進行鑒定，如進行。如通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。DNA的粗提取與鑒定實驗原理DNA不溶于，但某些蛋白質(zhì)溶于，利用這一原理，可初步分離DNA與蛋白質(zhì)。DNA在不同濃度的NaCl溶液中不同，它能溶于的NaCl溶液。DNA+藍色。實驗步驟【微點撥】【微點撥】研磨液中的部分成分及功能SDS（十二烷基硫酸鈉）：可使細胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)變性與DNA分離。EDTA（乙二胺四乙酸）：一種DNA酶抑制劑，防止細胞破碎后DNA酶降解DNA。Tris（三羥甲基氨基甲烷）：提供使DNA呈穩(wěn)定狀態(tài)的緩沖體系。提取DNA：玻璃棒上卷著的絲狀物是用冷卻的酒精析出的DNA。實驗注意事項破碎細胞應(yīng)徹底、充分。酒精必須經(jīng)過充分后才能使用。實驗過程中，攪拌時玻璃棒直插燒杯底部，并且攪拌要，并沿攪拌以便獲得較完整的DNA分子。將絲狀物溶于2mol/L的NaCl溶液中時，需要不斷攪拌以增加溶解的DNA的量。二苯胺試劑要，否則會影響鑒定的效果?？挤?基因工程及基本操作程序?qū)蚬こ谈拍畹睦斫饣蚬こ痰膭e名重組DNA技術(shù)操作對象基因操作水平分子水平原理基因重組優(yōu)點能克服遠緣雜交不親和的障礙，能定向改造生物性狀幾組概念的辨析黏性末端和平末端（2）限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶等相關(guān)酶的分析比較名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵DNA將DNA切開DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶或耐高溫的DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈3’末端DNA（水解）酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵和氫鍵核糖核苷酸將單個核糖核苷酸依次連接到單鏈RNA3’端關(guān)于限制酶的分析切割目的基因和載體時用同種限制酶的原因：產(chǎn)生相同的黏性末端。也可用不同的限制酶切割，但產(chǎn)生的黏性末端必須互補。作為載體必須具有多個限制酶切位點，而且每種酶的切點最好只有一個，原因是一種限制酶一般只能識別單一酶切位點，若載體上有一個以上的同種酶切位點，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制原點，則基因表達載體進入受體細胞后便不能自主復(fù)制。一個載體若只有限制酶的一個酶切位點，則酶切后既能把環(huán)打開以接納外源DNA片段，又不會丟失自己的片段。要獲取一個目的基因，需用限制酶剪切目的基因的兩端，共產(chǎn)生4個黏性末端或平末端。限制酶的選擇依據(jù)①根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類應(yīng)選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，可選擇圖中的PstI。不能選擇切割位點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，以防破壞目的基因，故不能選擇圖中的SmaI。為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因及質(zhì)粒，如圖中的PstI和EcoRI。②根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類③根據(jù)Ti質(zhì)粒的TDNA片段確定限制酶的種類（設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaI和SacI）圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取。（2023?云南二模）下列有關(guān)重組DNA技術(shù)的基本工具的敘述，正確的是（）A．限制酶能夠識別RNA分子的特定核苷酸序列 B．攜帶外源DNA片段的質(zhì)?？稍谑荏w細胞中進行復(fù)制 C．DNA連接酶不能連接雙鏈DNA片段的平末端 D．DNA連接酶能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵（2023?古冶區(qū)校級一模）載體是基因工程中攜帶外源DNA片段（目的基因）進入受體細胞的重要運載工具，常見的載體類型主要有基因克隆載體和基因表達載體。如圖是利用細菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程示意圖，下列相關(guān)敘述正確的是（）A．重組載體A、重組載體B分別是基因表達載體和基因克隆載體 B．載體A和載體B都必須含有限制酶切割位點、復(fù)制原點和標記基因 C．必須把目的基因插入重組載體A的啟動子和終止子之間 D．培養(yǎng)細菌A和細菌B的培養(yǎng)基在營養(yǎng)成分和功能上沒有明顯差異（2023?廈門模擬）如表為四種限制酶所識別的核苷酸序列及相應(yīng)的切割位置（箭頭所指），下列敘述正確的是（）限制酶種類序列及切點限制酶種類序列及切點①：EcoRⅠ5′﹣G↓AATTC﹣3′3′﹣CTTAA↑G﹣5′③：BglⅡ5′﹣A↓GATCT﹣3′3′﹣TCTAG↑A﹣5′②：BamHⅠ5′﹣G↓GATCC﹣3′3′﹣CCTAG↑G﹣5′④：NotⅠ5′﹣GC↓GGCCGC﹣3′3′﹣CGCCGG↑CG﹣3′A．①②③④可催化磷酸二酯鍵和氫鍵斷裂，形成黏性末端 B．① C．②、③切出的末端連接后形成的片段，不能再被②或③識別切割 D．構(gòu)建基因表達載體時，用②、③進行雙酶切，可防止目的基因與載體的反向連接（2023?杭州模擬）研究人員用EcoRⅠ和SmaⅠ兩種限制酶處理某DNA分子，圖1為EcoRⅠ切割該DNA分子后的結(jié)果；圖2是酶切后的凝膠電泳圖譜，其中1號泳道是DNAMarker，2號、3號、4號分別是EcoRⅠ單獨處理、SmaⅠ單獨處理、兩種酶共同處理后的電泳結(jié)果。下列相關(guān)敘述錯誤的是（）A．據(jù)圖1可知EcoRⅠ的識別序列為﹣GAATTC﹣，切割位點在G和A之間 B．據(jù)圖2可知瓊脂糖凝膠的加樣孔在B端，且連著電泳槽的負極 C．據(jù)圖2可知該DNA分子最可能是含1000個堿基對的環(huán)狀DNA D．據(jù)圖2可知該DNA分子中兩種限制酶的酶切位點各有一個（2023?福建模擬）2022年1月7日，馬蘭里醫(yī)學中心成功將豬心臟移植到一名57歲的心臟病患者身上，雖然這顆心臟僅僅存活了2個月，但仍然為異種器官移植的可行性提供了可觀的數(shù)據(jù)。為了降低免疫排斥反應(yīng)，研究者借助CRISPR/Cas9技術(shù)對移植的豬心臟進行了基因編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由向?qū)NA（sgRNA）和Cas9蛋白兩部分組成，sgRNA可引導(dǎo)Cas9蛋白到特定基因位點進行切割，其機制如圖所示。下列說法錯誤的是（）A．若要對一個基因進行編輯，則通常至少需要設(shè)計兩個序列不同的sgRNA B．sgRNA可以特異性識別目標DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯鍵 C．有時sgRNA會因錯誤結(jié)合而出現(xiàn)“脫靶”現(xiàn)象，一般sgRNA序列越短，脫靶率越低D．為降低免疫排斥反應(yīng)，可通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除相關(guān)抗原蛋白基因（2023?南充模擬）大米中鐵含量極低，科研人員通過基因工程、細胞工程等現(xiàn)代生物技術(shù)，培育出了鐵含量比普通水稻高60%的轉(zhuǎn)基因水稻，改良了大米的營養(yǎng)品質(zhì)。如圖為培育轉(zhuǎn)基因水稻過程示意圖，其中①～⑥為過程，EcoRⅠ，HindⅢ，BamHⅠ為限制酶。（1）完成圖中①過程需選用限制酶處理Ti質(zhì)粒和含目的基因的DNA。（2）②過程中用處理農(nóng)桿菌，使其成為感受態(tài)細胞。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理是：在農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上存在片段，它具有可以整合到受體細胞上的特點，使目的基因進入植物細胞并穩(wěn)定存在和表達。為了篩檢成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，1號培養(yǎng)基需要加入。（3）圖中過程，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)依據(jù)的基本原理（理論基礎(chǔ)）是。（2023?平度市模擬）北極比目魚體內(nèi)有抗凍基因，其編碼的抗凍蛋白具有11個氨基酸的重復(fù)序列，該序列重復(fù)次數(shù)越多，抗凍能力越強。如圖是獲取轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株的過程示意圖。下列有關(guān)敘述錯誤的是（）A．過程①獲取的目的基因含有啟動子和終止子 B．過程②涉及磷酸二酯鍵的斷裂與形成 C．農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T﹣DNA可將抗凍基因?qū)敕鸭毎?D．抗凍番茄植株中抗凍基因與比目魚體內(nèi)抗凍基因堿基序列可能不同（2023?遼寧二模）為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb＝1000堿基對），利用大腸桿菌表達該蛋白。圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識別序列及切割位點如表，phb2基因序列不含圖1中限制酶的識別序列。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌提取質(zhì)粒，再用選中的兩種限制酶進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，結(jié)果如圖2。下列敘述錯誤的是（）相關(guān)限制酶的識別序列及切割位點（注：箭頭表示切割位點）名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割位點HindⅢA↓AGCTTTTCGA↑AEcoRⅠG↓AATTCCTTAA↑GPvitⅡCAG↓CTGGTC↑GACPstⅠGA↑CGTCGA↑CGTCKpnⅠG↓GATCCCCATG↑GBamHⅠG↓GATCCCCTAG↑GA．需設(shè)計特異性的引物通過PCR技術(shù)擴增phb2基因 B．為使phb2基因與載體正確連接，在擴增的phb2基因兩端分別引入KpnⅠ和EcoRⅠ兩種不同限制酶的識別序列 C．經(jīng)過兩種限制酶酶切的phb2基因與載體進行連接時，可選用T4DNA連接酶 D．圖2中3號的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒31．（2023?廣東二模）二倍體馬鈴薯受核糖核酸酶基因（S﹣RNase）影響，普遍存在自交不親和的現(xiàn)象一一自交不產(chǎn)生種子，我國科研人員通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除了馬鈴薯的S﹣RNase基因，獲得自交親和的二倍體馬鈴薯如圖示該技術(shù)的原理：由一條單鏈向?qū)NA引導(dǎo)內(nèi)切核酸酶Cas9蛋白到一個特定的基因位點進行切割。下列敘述錯誤的是（）A．向?qū)NA和S﹣RNase基因識別結(jié)合的堿基互補配對方式與目標DNA雙鏈中的堿基互補配對方式相同 B．Cas9蛋白可催化磷酸二酯鍵水解，剪切特定DNA片段 C．可讓馬鈴薯自交看能否產(chǎn)生種子，從個體水平上檢測該基因編輯技術(shù)是否成功 D．向?qū)NA的序列越短，該基因編輯技術(shù)在編輯對象時出錯的概率就越高33．（2023?通許縣三模）研究表明，服用α﹣干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。人參是一種名貴藥材，具有較好的滋補作用。限制酶的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割和功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的識別序列及切割位點分別為↓GATC、G↓AATTC、C↓GATCC。含干擾素基因的DNA片段如圖1所示，圖2為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程圖，①～④表示相關(guān)的操作。請回答下列問題：（1）結(jié)合上圖，在構(gòu)建基因表達載體時，為克服目的基因和農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒的任意連接等，應(yīng)選擇用限制酶處理含某目的基因的DNA和質(zhì)粒。（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學鍵是。（3）圖2操作①常利用PCR技術(shù)獲取和擴增干擾素基因，除含有干擾素基因的DNA片段之外，該過程需要提供以及與干擾素基因兩端兩條模板鏈結(jié)合的兩種引物。設(shè)計引物時，為了保證目的基因與質(zhì)粒順利連接，防止出現(xiàn)自身環(huán)化連接，需要在兩種引物的一端分別加上EcoRⅠ和BamHⅠ的識別序列。（4）圖2步驟②除EcoRⅠ、BamHⅠ兩種酶外，還需要用酶。構(gòu)建的基因表達載體除含有目的基因片段以外，還必須有，以保證干擾素基因能在人參愈傷組織細胞中穩(wěn)定存在和表達。同時，還應(yīng)含有標記基因以便于。（5）圖2操作④常用技術(shù)檢測干擾素基因是否成功表達出干擾素?？挤?（實驗）DNA的粗提取與鑒定（2023?上虞區(qū)模擬）關(guān)于“DNA的粗提取和鑒定”實驗，下列說法正確的是（）A．研磨時倒入的研磨液，是為了破壞細胞壁 B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀 C．在DNA提取物中加入二苯胺，迅速呈現(xiàn)藍色 D．提取DNA時要用玻璃棒沿一個方向緩緩攪動（2023?山東模擬）下列與DNA粗提取和鑒定有關(guān)的敘述，錯誤的是（）A．預(yù)冷的酒精容易使DNA析出 B．DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液中 C．若提取出白色絲狀物，說明DNA中雜質(zhì)少 D．可用堿性染料甲紫鑒定提取出來的DNA考法3PCR的基本操作和應(yīng)用物質(zhì)條件引物：PCR所用的引物是一小段單鏈RNA或單鏈DNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對。DNA復(fù)制之所以需要引物，是因為DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從引物的3’端延伸DNA鏈。PCR的引物通常由20~30個核苷酸聚合而成，引物的量需保證滿足幾十次循環(huán)反應(yīng)的需要。DNA聚合酶：PCR中所用的酶是一種從嗜熱菌中分離得到的耐高溫的DNA聚合酶，高溫條件下不會失活。反應(yīng)體系中加入Mg2+，可以使酶催化的活化能更加降低，使得反應(yīng)能夠進行得更加容易。PCR擴增與DNA復(fù)制的比較PCR擴增DNA復(fù)制不同點場所在體外的反應(yīng)緩沖液中進行在體內(nèi)的活細胞內(nèi)進行解旋方式高溫變性解聚解旋酶解旋擴增過程完全解聚再復(fù)制，分為變性、復(fù)性（或退火）和延伸三個步驟邊解旋邊復(fù)制引物DNA或RNARNA結(jié)果短時間內(nèi)形成大量的DNA片段形成的是整個DNA分子相同點①都需要DNA模板、DNA聚合酶、引物、四種脫氧核苷酸等成分；②都遵循堿基互補配對原則，有解聚和延伸過程，子鏈延伸的方向都是從5’端到3’端；③都屬于半保留復(fù)制；④結(jié)果都使DNA數(shù)量呈2n的指數(shù)式擴增PCR的應(yīng)用分析人的血液，對細菌、病毒感染情況進行早期診斷。用于遺傳病的基因診斷與基因治療。用于鑒別犯罪嫌疑人、親子鑒定。分析生物化石樣品，追溯其生存年代或遷徙蹤跡。檢測目的基因是否已經(jīng)插入目標生物染色體DNA和目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。PCR產(chǎn)物的電泳鑒定：一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。①電泳概念：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動。②電泳原理：在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。（2023?滄縣校級模擬）基于聚合酶制造的PCR儀實際上是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度、延伸溫度之間很好地進行切換，主要過程如圖所示。下列有關(guān)敘述錯誤的是（）A．實施上述過程的前提是已知目的基因的一段核苷酸序列 B．圖中a、b、c過程控制的溫度由高到低依次是過程a、c、b C．耐高溫的DNA聚合酶沿著5'→3'的方向合成互補子鏈 D．c延伸過程中需要緩沖溶液、ATP和四種核糖核苷酸（2023?肥城市模擬）通過設(shè)計引物，運用PCR技術(shù)可以實現(xiàn)目的基因的定點誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5′端分別設(shè)計增加限制酶a和限制酶b的識別位點。有關(guān)敘述正確的是（）A．在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離核苷酸、解旋酶、Taq酶等B．第2輪PCR，引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長的突變基因C．引物中設(shè)計兩種限制酶識別位點有利于目的基因定向插入運載體 D．第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占（2023?湖北模擬）乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物質(zhì)，由乳酸脫氫酶催化產(chǎn)生，影響白酒品質(zhì)和風格?？蒲腥藛T將釀酒酵母質(zhì)粒上的丙酮酸脫氫酶基因（PD）替換為植物乳桿菌中的乳酸脫氫酶基因（L﹣PG），可獲得乳酸乙酯高產(chǎn)菌株，該過程如圖所示。下列說法不正確的是（）A．可借助序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）等查詢L﹣PG基因的序列和功能 B．可以利用PCR技術(shù)篩選導(dǎo)入了L﹣PG基因的受體細胞 C．酵母菌PD基因被替換為L﹣PG基因的過程中發(fā)生了基因重組 D．電泳鑒定L﹣PG基因時，當觀察到核酸染料遷移至凝膠邊緣時，停止電泳（2023?博白縣模擬）細菌病的防治一直是困擾人類的難題之一，特別是長期使用抗生素，許多細菌產(chǎn)生了明顯的耐藥性。通過基因工程和胚胎工程生產(chǎn)抗菌肽，是研制新型抗菌藥物的有效途徑。回答下列問題：（1）生產(chǎn)抗菌肽所需的抗菌肽基因，可用技術(shù)大量擴增。擴增過程中需要將溫度冷卻至55～60℃，這步叫復(fù)性，目的是。獲得大量抗菌肽基因后，為了使其和質(zhì)粒能正確地成功拼接，一般操作方法是用切割含抗菌肽基因的DNA片段和質(zhì)粒。（2）抗菌肽基因?qū)胧荏w細胞后，可利用放射性同位素標記的目的基因的DNA片段作為，目的是檢測。（3）一般科學家將抗菌肽基因?qū)胧芫?，以培育出能產(chǎn)生抗菌肽的轉(zhuǎn)基因動物，請分析選擇受精卵作為受體細胞的原因是。（4）受精卵在體外培養(yǎng)到早期胚胎過程中，需用培養(yǎng)液培養(yǎng)。早期胚胎發(fā)育到適宜的時期再將胚胎移植到代孕母體的子宮里，用這種方法得到的動物稱為（填“克隆動物”或“試管動物”）。（2023?廈門模擬）如圖表示PCR過程中某個階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是（）A．②鏈從L到R的方向為3′→5′，①②鏈均可作為子鏈合成的模板 B．PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制 C．以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個引物③ D．物質(zhì)③的5′端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物（2023?濱州二模）巢式PCR是指先后用外內(nèi)引物擴增目的基因的方法。其原理為：先以比目的基因大的DNA片段為模板，用外引物（F1，R1）進行擴增，獲得大量含目的基因的中間產(chǎn)物，再以擴增后的中間產(chǎn)物為模板，用內(nèi)引物（F2，R2）擴增目的基因，如圖所示。下列說法錯誤的是（）A．PCR反應(yīng)緩沖液中Mg2+的作用是激活DNA聚合酶 B．與傳統(tǒng)PCR相比，巢式PCR能有效提高產(chǎn)物中目的基因的比例 C．由于和兩套引物都互補的靶序列較少，該技術(shù)可大大提高擴增的特異性 D．如果兩套引物一起加入反應(yīng)體系中，外引物的復(fù)性溫度應(yīng)顯著低于內(nèi)引物（2023?大東區(qū)校級四模）單分子熒光測序技術(shù)原理如圖所示。某種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）提供一個相應(yīng)的脫氧核苷酸連接到DNA子鏈上的同時，會產(chǎn)生一分子的焦磷酸（PPi），一分子的PPi可以通過一系列反應(yīng)使熒光素發(fā)出一次熒光，通過檢測熒光的有無可推測模板鏈上相應(yīng)位點的堿基種類。下列說法錯誤的是（）A．