綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)課件

綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)概覽和實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)過程綠色熒光蛋白(,簡稱)基因來源于，是等于年發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，由個(gè)氨基酸組成，分子量約為。在包括熱、極端和化學(xué)變性劑等苛刻條件下都很穩(wěn)定在熒光顯微鏡下，用波長約的紫外線激發(fā)后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測；無需任何的作用底物或共作用物,檢測的靈敏度不受反應(yīng)效率的影響，保證了極高的檢出率；蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定；可在多種異源生物中表達(dá)且無細(xì)胞毒性；其基因片段長度較小(約)，易于構(gòu)建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性是一種優(yōu)化的突變型，使其產(chǎn)生的熒光較普通強(qiáng)倍，大大增強(qiáng)了其報(bào)告基因的敏感度。與其他蛋白的融合表達(dá)已有很多成功的例子。絲氨酸－酪氨酸－甘氨酸生色基團(tuán)蛋白質(zhì)折疊，生色基團(tuán)得以“親密接觸”,經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮,并發(fā)生脫水反應(yīng)。但此時(shí)還不能發(fā)射熒光,只有當(dāng)有分子氧存在的條件下,發(fā)生氧化脫氫,方能導(dǎo)致綠色熒光蛋白發(fā)色團(tuán)的“成熟”,形成可發(fā)射熒光的形式。藍(lán)光、綠光與黃光基因克隆變體分子標(biāo)記藥物篩選融合抗體生物傳感器信號傳導(dǎo)標(biāo)記！真核細(xì)胞表達(dá)載體，載體上攜帶有蛋白表達(dá)基因很強(qiáng)的復(fù)制能力高效的功能強(qiáng)大的啟動子和多克隆位點(diǎn)具有基因，可以采用來篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體的靶細(xì)胞系統(tǒng)（）原核蛋白表達(dá)引用最多的系統(tǒng)在任何表達(dá)系統(tǒng)中，基礎(chǔ)表達(dá)水平最低真正的調(diào)節(jié)表達(dá)水平的“變阻器”控制提供各種不同融合標(biāo)簽和表達(dá)系統(tǒng)配置具有可溶性蛋白生產(chǎn)、二硫鍵形成、蛋白外運(yùn)和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌許多載體以載體試劑盒方式提供，用于迅速定向克隆產(chǎn)物許多宿主菌株以感受態(tài)細(xì)胞形式提供，可立即用于轉(zhuǎn)化（）表達(dá)菌株表達(dá)載體和宿主菌的選擇（）是表達(dá)宿主菌實(shí)驗(yàn)內(nèi)容得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株（）經(jīng)培養(yǎng)后用進(jìn)行三個(gè)時(shí)間梯度的誘導(dǎo)表達(dá)，紫外線下觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩亟M蛋白的基因表達(dá)和蛋白檢測設(shè)計(jì)思想學(xué)習(xí)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)主要操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)器材與儀器實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)思路實(shí)驗(yàn)步驟將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株·制備（）菌株的感受態(tài)細(xì)胞

（）菌液接入液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)過夜二次活化：比例接入新的試管搖床培養(yǎng)冰上度，離心收集細(xì)胞棄培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的液，輕懸，冰上，度，離心棄上清液，加入預(yù)冷的液，輕懸，冰上，度，離心棄上清液，加入預(yù)冷的液，輕懸，即可·將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（）菌中分成份，份分別加入重組質(zhì)粒，輕勻，冰上；份平行操作（對照）度水浴熱擊，迅速冰上冷卻兩管中分別加入液體培養(yǎng)基，勻，度振蕩培養(yǎng)涂平板：）分別取、、加入重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞懸液涂布于含抗生素的平板）抗生素板重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞懸液）對照組感受態(tài)細(xì)胞抗生素平板）正面向上放置片刻，后度倒置培養(yǎng)誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)重組陽性克隆菌接至（）液體培養(yǎng)基中，度培養(yǎng)過夜菌比例接種至支試管中（每支試管含()），擴(kuò)大培養(yǎng)，測量值為，停止分別使用